鄭文清 張倩 杜亮

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

Small RNA包括微小RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA），它們?cè)谥参锏纳L、發(fā)育、表觀遺傳、染色體完整、抵御病毒感染，以及對(duì)環(huán)境的改變作出響應(yīng)中扮演著重要的角色［1-4］。其中，miRNA主要通過轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能［5］，而siRNA在RNA干擾和轉(zhuǎn)錄基因的沉默中都發(fā)揮著重要的作用［3］。目前為止，隨著許多物種的高通量測序的完成，很多物種的miRNA被鑒定出來［6］。盡管如此，研究miRNA的技術(shù)仍然相對(duì)匱乏［7］。傳統(tǒng)的研究基因功能方法最典型的特點(diǎn)是依賴于突變體［8］，但是這種方法不適用于miRNA的研究。其原因主要包括：miRNA基因較小、家族成員多、每個(gè)miRNA可能靶向調(diào)控多個(gè)下游基因等。在人們?cè)缙趯?duì)miRNA功能的研究工作中，主要是通過過表達(dá)miRNA或者表達(dá)miRNA-resistant的靶標(biāo)基因［9］，達(dá)到調(diào)控miRNA功能的目的。但是，這兩種方式都有缺陷：其中，由于每個(gè)miRNA都有多個(gè)靶標(biāo)基因，過表達(dá)miRNA基因會(huì)導(dǎo)致其所有靶標(biāo)基因表達(dá)水平的下降，因此這些方法不能很好地反映某個(gè)特定的miRNA的功能；而對(duì)于傳統(tǒng)miRNA-resistant技術(shù)，同樣存在靶向性不強(qiáng)的問題。

近年來隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，開發(fā)了一種對(duì)miRNA功能研究比較有效的技術(shù)，即“短串聯(lián)靶標(biāo)模擬”（Short tandem target mimic，STTM）技術(shù)。STTM是一個(gè)人工構(gòu)建的非編碼RNA（100 nt左右大?。蓛蓚€(gè)miRNA互補(bǔ)序列和一段中間序列組成，它可以通過穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化或者病毒介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在植物中表達(dá)［10］。通過檢測一些影響STTM表達(dá)效率的參數(shù)，可以推導(dǎo)出設(shè)計(jì)最好的STTM的一般規(guī)則。與之前的幾種技術(shù)相比，如“靶標(biāo)模擬”（Target mimic，TM）［11］、“miRNA sponge”［12-15］和其他一些RNA引 誘 的 類 型 如“tough decoy（TuD）RNAs”［16-17］，該技術(shù)可以在體內(nèi)特異地誘導(dǎo)miRNA的降解，且已經(jīng)成功應(yīng)用于擬南芥［18］、煙草［10］、大豆［19］、番茄［20］、棉花［21］、小麥［22-23］和水稻［24］等的miRNA功能研究中［25］。本文將在介紹這個(gè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對(duì)應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)等進(jìn)行總結(jié)，以期為更好地利用該技術(shù)來研究植物miRNA的功能奠定基礎(chǔ)。

1 STTM

1.1 STTM的發(fā)現(xiàn)

STTM最初是以“靶標(biāo)模擬”現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)建立的。早期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物處于磷饑餓狀態(tài)時(shí)，miR399和一個(gè)非蛋白編碼基因IPS1（INDUCE BY PHOSPHATE STARVATION 1）被誘導(dǎo)表達(dá)，與此同時(shí)，miR399靶基因PHO2的表達(dá)量顯著地下降［11］。序列比對(duì)顯示了IPS1的RNA和PHO2的mRNA都可以有效地結(jié)合miR399。PHO2mRNA當(dāng)與miR399結(jié)合時(shí)，被特異地切割，進(jìn)而抑制了PHO2的轉(zhuǎn)錄水平。但是，當(dāng)IPS1表達(dá)量上升時(shí)，IPS1RNA與miR399發(fā)生競爭性結(jié)合，阻礙了miR399對(duì)PHO2mRNA的切割。因此，IPS1RNA有效地模擬（Target mimic）了PHO2mRNA，作為一個(gè)誘餌吸引了miR399進(jìn)而保護(hù)了PHO2的mRNA不被切割降解［11］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IPS1 RNA與 miR399的結(jié)合序列不同于PHO2mRNA與miR399的結(jié)合序列，在其第10和11位序列之間加了CUA三個(gè)額外的堿基，形成了一個(gè)凸起的結(jié)構(gòu)。這3個(gè)堿基使得IPS1RNA不能被miRNA399切割。運(yùn)用IPS1RNA的這種特殊的結(jié)構(gòu)，可以阻礙miRNA對(duì)mRNA靶序列發(fā)揮作用，間接保護(hù)靶基因，這種技術(shù)被稱為“靶標(biāo)模擬”。但是，并非所有的miRNA都能通過TM有效地被阻遏與靶基因的結(jié)合。例如，修飾過的IPS1RNA在植物中阻礙miR166/165的活性，效果不是特別顯著［18］。這可能是由于修飾過的IPS1RNA的結(jié)合活性或者結(jié)構(gòu)存在問題，或者是在植物發(fā)育到一定階段時(shí)，被抑制的miR166/165又重新被激活。此外，miR166/165所在家族成員眾多，這些成員由于序列上的相似性可能會(huì)與miRNA166/165競爭性結(jié)合IPS1RNA［18］。為了解決這個(gè)問題，早期的研究者對(duì)模擬序列的結(jié)構(gòu)做了優(yōu)化，并且發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時(shí)引入了兩個(gè)串聯(lián)miRNA結(jié)合位點(diǎn)序列時(shí)，模擬結(jié)合的效率大大提高，由此建立miRNA靶標(biāo)模擬技術(shù)［18］。

1.2 STTM的結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)

STTM含有兩段不能被切割的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，中間由一段spacer序列連接（圖1）。這兩段miRNA結(jié)合位點(diǎn)可以是相同的，靶標(biāo)一個(gè)或者一類miRNA；或者不相同，靶標(biāo)同一家族的不同miRNA。為了使STTM達(dá)到一個(gè)比較好的效果：第一，不推薦使用兩個(gè)不同家族的完全不同的miRNA，這是因?yàn)橐欢蝝iRNA結(jié)合位點(diǎn)不能夠有效地靶標(biāo)一個(gè)miRNA。第二，miRNA結(jié)合位點(diǎn)的第10和11個(gè)堿基（成熟miRNA的5'端）之間應(yīng)該有一個(gè)CUA三堿基的凸起，這樣可以保證STTM序列不被miRNA切割。一些miRNA可能恰巧在第10位堿基之后有可以和STTM結(jié)構(gòu)的CUA互補(bǔ)的UAG結(jié)構(gòu)，這可能導(dǎo)致突起位置的轉(zhuǎn)換和STTM的斷裂。在這種情況下，應(yīng)該使用其他的三堿基結(jié)構(gòu)。第三，spacer序列的長度最好是從48-88 nt，且是富含AT，以便形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

圖1 STTM結(jié)構(gòu)示意圖［26］

1.3 影響STTM效率的因素

1.3.1 Spacer的序列長度 STTM由兩個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)和一段spacer序列構(gòu)成。這段連接序列可能可以控制細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶的活性，因此對(duì)于穩(wěn)定STTM的結(jié)構(gòu)起著至關(guān)重要的作用。并且這段中間的連接序列的長短對(duì)于miRNA調(diào)控靶基因有著比較重要的作用［27-29］。在擬南芥中，分別構(gòu)建了STTM165/166-8、31、48、88和96 nt（后面的數(shù)字表示spacer堿基序列的長度）并導(dǎo)入植物中，通過表型變化的嚴(yán)重程度觀察對(duì)miR165/166功能的阻礙作用。結(jié)果表明，當(dāng)spacer序列長度為8 nt時(shí)，STTM轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型相似；當(dāng)增加spacer序列到31 nt、48 nt和88 nt時(shí)，隨著spacer序列長度的增加，生長抑制的表型逐漸加重，而spacer序列為96 nt時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株生長抑制的表型不再加重，表明spacer比較合適的長度是88 nt［24］。由此可見，STTM中spacer序列長度對(duì)miRNA的抑制效果有顯著影響。

1.3.2 STTM熱穩(wěn)定性和次級(jí)結(jié)構(gòu) Yan等［18］分析了STTM165/166-8、31和48的RNA次級(jí)結(jié)構(gòu)。通過RNA折疊分析表明，STTM165/166-8 RNA的結(jié)構(gòu)有-211.7 kcal/mol的dG，相當(dāng)不穩(wěn)定。STTM165/166-31和48預(yù)測有低于-20 kcal/mol的dG，比STTM165/166-8有更高的穩(wěn)定性。因此推測STTM165/166-8的效率低是因?yàn)樗牡头€(wěn)定性。STTM165/166-31的穩(wěn)定性比48更高，但是它們的效率恰好相反。對(duì)它們的折疊結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，STTM165/166-48形成了一個(gè)比較穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)?？偟膩碚f，這些分析表明了STTM轉(zhuǎn)錄本的熱穩(wěn)定性和次級(jí)結(jié)構(gòu)都會(huì)影響STTM的效率，在設(shè)計(jì)時(shí)要綜合考慮。

1.3.3 啟動(dòng)子選擇 在個(gè)體中表達(dá)STTM序列時(shí)，可以選擇組成型、組織特異型或者誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子。大多數(shù)情況下，為了研究miRNA在植物和動(dòng)物中的全部功能，組成型表達(dá)STTM可以揭示出miRNA缺失功能在不同的發(fā)育階段的影響。在這種情況下，RNA聚合酶II如35S或者2×35S、CMV/EF-1a和polⅢ啟動(dòng)子如U6都可以使用［16，23-24，26］。為了更加準(zhǔn)確地研究miRNA的功能，需要組織特異性的或暫時(shí)的表達(dá)STTM，在這種情況下，可以使用特異的啟動(dòng)子。但是，當(dāng)選用組織特異型或者誘導(dǎo)型啟動(dòng)子時(shí)，要注意啟動(dòng)子效率對(duì)STTM調(diào)控效果的影響［18］。

1.4 參與STTM作用過程的核酸外切酶

SDN蛋白家族的核酸外切酶參與了small RNA的降解，可能參與了STTM介導(dǎo)的miRNA降解［30］。為了證實(shí)這一想法，2012年Yan等［18］分別在野生型和sdn1-1 sdn2-1擬南芥雙突變體背景下表達(dá)STTM165/166-48并觀察其對(duì)植株表型的影響。結(jié)果顯示95%的含有STTM165/166-48的雙突變體沒有表現(xiàn)出明顯的表型變化，而90%的含有STTM165/166-48的野生型植株都表現(xiàn)出了明顯的表型。qRT-PCR結(jié)果顯示，兩種背景下的STTM165/166-48的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平相似，但是，突變體背景下的miR165/166的表達(dá)水平比野生型的高很多。同時(shí)，在sdn1-1 sdn2-1雙突變體背景下表達(dá)STTM156/157-48，表型變化也出現(xiàn)類似的結(jié)果。這些研究表明，SDN蛋白家族是STTM得以發(fā)揮作用的重要核酸外切酶［18］。

2 STTM與TM和SP技術(shù)比較

MiRNA功能的鑒定通過之前傳統(tǒng)的缺失功能的方法被證明是比較困難的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)miRNA家族成員具有功能冗余性。在miRNA沉默技術(shù)中，STTM與TM和SP較為相似，都是通過降低內(nèi)源的miRNA表達(dá)水平發(fā)揮調(diào)控作用，但又各有特點(diǎn)。

2.1 TM原理以及應(yīng)用

2007年，F(xiàn)ranco-Zorrilla等［11］在研究擬南芥低磷脅迫響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)了TM現(xiàn)象，并利用該技術(shù)研究了miRNA的一些功能。在該研究中，PHO2是miR399的靶基因，miR399通過剪切PHO2基因進(jìn)而影響基因的表達(dá)。IPS1可以與miR399配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而影響了miR399與PHO2的配對(duì)結(jié)合，增加了PHO2基因的表達(dá)，維持了體內(nèi)的磷平衡。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，IPS1的結(jié)構(gòu)即是在miR399的第10和第11個(gè)堿基之間多了3個(gè)堿基（CUA），正是由于這3個(gè)堿基造成了IPS1能夠與miR399結(jié)合但是不能被miR399切割（圖2）。同時(shí)，他們根據(jù)IPS1的結(jié)構(gòu)又構(gòu)建了miR156和miR319的TM載體，并且轉(zhuǎn)化了野生型擬南芥，擬南芥表現(xiàn)出比較明顯的表型，miR156和miR319的表達(dá)量有一定程度的下降。Todesco等［31］利用TM 技術(shù)構(gòu)建了一系列miRNA的載體，進(jìn)行了擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，為研究miRNA的功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

2.2 Sponges（SPs）原理及應(yīng)用

在前人的研究中，證明“miRNA sponges”在動(dòng)物中對(duì)miRNA的抑制效果比較有效［12］。SPs是包含了多個(gè)感興趣的miRNA結(jié)合位點(diǎn)的合成轉(zhuǎn)錄本，它的工作原理主要是作為miRNA的誘餌，阻礙目標(biāo)miRNA與其靶標(biāo)mRNA的結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)mRNA的表達(dá)。每個(gè)SP內(nèi)部含有2個(gè)堿基的錯(cuò)配，并且每個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)中間含有4個(gè)堿基的連接序列（圖3）。SP中多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和多個(gè)連接序列增強(qiáng)了SP結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。并且由于SP結(jié)構(gòu)序列較長，因此構(gòu)建和轉(zhuǎn)化比較困難。SP主要運(yùn)用在動(dòng)物中，在植物中的研究較少。Reichel等［33］在植物中構(gòu)建了cmSP165/166 和cmSP159載體，轉(zhuǎn)化擬南芥植株，產(chǎn)生了比較明顯的表型。

圖2 IPS1介導(dǎo)的miR399的TM工作原理示意圖［32］

圖3 SP技術(shù)的構(gòu)建示意圖［34］

2.3 STTM與TM、SP技術(shù)的比較

STTM與TM、SP技術(shù)的比較首先從其結(jié)構(gòu)上來說，STTM包含兩個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的第10和第11個(gè)堿基之間多出3個(gè)額外的堿基（CUA），連接序列較長（48-88 nt）。TM包含一個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，并且miRNA結(jié)合位點(diǎn)的第10和第11個(gè)堿基之間也多出3個(gè)額外的堿基（CUA），沒有連接序列，而SPs通常包含4-15個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部含有2個(gè)堿基的錯(cuò)配，連接序列較短（4 nt）。其次，STTM與TM、SP技術(shù)從其作用機(jī)制上來說，都是RISC和RNA相互作用誘導(dǎo)miRNA的降解（表1）。

表1 TM、SP和STTM技術(shù)的比較

STTM、TM和SP這3個(gè)技術(shù)均有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。由于STTM的結(jié)構(gòu)較短，因此構(gòu)建比較容易，并且由于STTM比TM多一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此效率較高，特異性較強(qiáng)。另外，STTM技術(shù)介導(dǎo)的miRNA的降解過程不可逆，阻礙miRNA的表達(dá)較顯著，轉(zhuǎn)基因植株表型穩(wěn)定［18，35］，但是STTM技術(shù)不適用于研究低表達(dá)豐度的miRNA。TM技術(shù)由于其結(jié)構(gòu)較短，因此構(gòu)建也比較容易，但是由于其只有一個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，因此不適用于有多個(gè)成員的miRNA家族。研究表明，SP技術(shù)在動(dòng)物中的沉默效果較好，但是由于其結(jié)構(gòu)較長，因此構(gòu)建比較困難［12］。

3 STTM在植物中的應(yīng)用

3.1 STTM在miR165/166研究中的應(yīng)用

MiR165/166是植物中最豐富的miRNA家族之一，并且影響著包括葉、花、根和維管組織的許多發(fā)育過程。在擬南芥基因組中有2個(gè)miR165基 因（miR165a、miR165b）和7個(gè)miR166基 因（miR166a-g）［36］。成熟的miR165和miR166基因只在第17個(gè)堿基上有C/U的不同。在擬南芥中過表達(dá)miRNA165a、miR165b或者miR166a都有相似的表型，說明了它們的功能具有冗余性。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR165/miR166的靶基因包括HD-ZIPⅢ家族的5個(gè)成員，分別是PHABULOSA（PHB）/ ATHB14、PHAVOLUTA（PHV）/ ATHB9、INTERFASCICULAR/FIBERLESS/REVOLUTA（IFL1/REV）、INCURVATA4/ CORONA / ATHB15和ATHB8［34］。這些基因調(diào)控許多植物發(fā)育過程，如頂端分生組織和側(cè)生分生組織的形成、葉片的極性、維管組織形態(tài)和花的發(fā)育等過程［37-43］。

在擬南芥中，過表達(dá)STTMmiRNA165/166植株的表型與PHB基因的顯性抑制突變體phb-1d相似但更明顯。Small RNA免疫印跡和深度測序都證明了在STTM165/166轉(zhuǎn)化植株中，超過95%的miRNA165/166被 降 解［18］。擬 南 芥 中 過 表 達(dá)STTM160和STTM165/166影響葉片的發(fā)育和干旱抗性［44］。在水稻中過表達(dá)STTM166，植株葉片卷曲，并且葉片有較小的泡狀細(xì)胞和不正常的后壁組織細(xì)胞，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率降低，這些表型與過表達(dá)miR166-resietent的OsHB4基因的表型是相似的［45］。另一個(gè)研究表明，在水稻中導(dǎo)入STTM165/166 后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出葉形彎曲、植株矮化等表型［46］。在番茄中，過表達(dá)STTM165/166-31，亦能顯著降低內(nèi)源的miRNA165/166水平，同時(shí)增強(qiáng)其靶基因的表達(dá)水平［47］。在棉花中，過表達(dá)pCLCrVASTTM165/166，導(dǎo)致miRNA165/166表達(dá)降低，并造成棉花葉片的卷曲［48］。

3.2 STTM在其他miRNA中研究的應(yīng)用

2017年，Zhang等［24］通過STTM在水稻中產(chǎn)生了35個(gè)miRNA家族的轉(zhuǎn)基因株系，以期改良農(nóng)作物的性狀。在STTM轉(zhuǎn)基因株系中，表現(xiàn)出了許多有價(jià)值的農(nóng)業(yè)性狀的改變，包括株高，分蘗數(shù)目，谷物數(shù)量，并且在五代以上都是穩(wěn)定的。其中，STTM398能夠增加花序長度，谷物的數(shù)量和大?。籗TTM172的水稻轉(zhuǎn)基因株系相比野生型有非常短的莖，導(dǎo)致了封閉的花序和矮小的植株，而且相比野生型有更短的和密度更大的花序；STTM156的轉(zhuǎn)基因植株根的發(fā)育受到影響，表明miRNA156參與了根的發(fā)育調(diào)控［24］。除此之外，在水稻中還產(chǎn)生 了STTM159、STTM160、STTM171、STTM441和STTM1428株系，且均產(chǎn)生了比較明顯的表型［24］。在煙草幼苗中，Liu等［49］通過ZMBJ-CMV-2bN81-STTM載體降低了Nbe-miR165/166和Nbe-miR159的表達(dá)，并產(chǎn)生了較明顯的表型。在玉米幼苗中，利用同樣的載體降低了zma-miR167 和 zma-miR482的表達(dá)，分別產(chǎn)生了側(cè)根數(shù)目減少和生長遲緩的表型。在番茄中，過表達(dá)STTM396的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)及萼片顯著變大，miR396a和miR396b的表達(dá)量都顯著下調(diào)，表明miR396對(duì)于番茄果實(shí)及萼片的大小有調(diào)控作用［50］。在番茄中利用STTM技術(shù)降低了miR482b的表達(dá)，表明了miR482b對(duì)番茄抵抗致病疫霉的負(fù)調(diào)控作用［51-52］。STTM9678轉(zhuǎn)基因小麥增強(qiáng)了種子的萌發(fā)率，揭示了miR9678通過產(chǎn)生階段性的siRNA和調(diào)控ABA或者赤霉素信號(hào)來影響小麥種子的萌發(fā)［53］。在蒺藜狀苜蓿的根中，利用STTM技術(shù)對(duì)miRNA進(jìn)行了失活［54］。STTM393的轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)了對(duì)大豆疫霉菌的超敏感，并且異黃酮生物合成基因的表達(dá)也急劇下降［55］。在大豆中過表達(dá)STTM1507a、STTM1507c、STTM482a、STTM403a、STTM168a、STTM162b和STTM1515a，增強(qiáng)了大豆對(duì)花葉病毒的抵抗力［56］。STTM472a轉(zhuǎn)基因楊樹揭示了miR472a參與到對(duì)壞死真菌的抗性中［57］。STTM164轉(zhuǎn)基因楊樹相比野生型表現(xiàn)出木質(zhì)部加厚的表型，表明miR164在楊樹次生細(xì)胞壁合成過程中的作用［58］。干旱處理的菜豆中過表達(dá)STTM1514a，其靶基因NAC700的表達(dá)量上調(diào)，并降低了NAC誘導(dǎo)的phasiRNA的表達(dá)［59］。大麥中VIGS介導(dǎo)的STTM9683，miR9863a/b.2 和 miR9863c/b.1的表達(dá)量降低，Mla1基因表達(dá)量上升［60］。

4 展望

miRNA在植物的生長發(fā)育過程以及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著比較重要的作用，近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，很多植物的miRNA被鑒定出來，因此研究miRNA的功能顯得尤為重要。研究表明，STTM技術(shù)在研究植物miRNA及其家族基因功能中有操作簡便、靶向性強(qiáng)等顯著優(yōu)勢，是未來植物miRNA功能研究的有效技術(shù)。并且，由于STTM的結(jié)構(gòu)比較小，因此可以將STTM串聯(lián)起來誘導(dǎo)多個(gè)miRNA的降解，這將有力推動(dòng)miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)功能以及miRNA之間互作的研究工作。同時(shí)，在實(shí)際應(yīng)用中，由于STTM序列的穩(wěn)定性受多個(gè)因素控制，如spacer序列的長度，RNA的熱穩(wěn)定性、次級(jí)結(jié)構(gòu)等。因此，選擇一種比較穩(wěn)定的STTM結(jié)構(gòu)對(duì)研究miRNA的功能顯得尤為重要。研究表明，48-88 nt長度的spacer序列是最理想的，太長序列的spacer可能對(duì)STTM的穩(wěn)定性起不到比較明顯的作用，反而會(huì)增加轉(zhuǎn)化等的困難，太短長度的spacer序列可能不利于STTM結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。而且在啟動(dòng)子的選擇上面可能也需要根據(jù)不同的miRNA表達(dá)情況來選擇合適的啟動(dòng)子。此外，植物的MiRNA家族成員比較多，并且成員間往往表現(xiàn)為功能冗余；因此，在使用STTM技術(shù)對(duì)目標(biāo)MiRNA家族進(jìn)行表達(dá)干擾時(shí)，一般需要清楚地知道目標(biāo)植物的基因組信息，以便進(jìn)行精確和恰當(dāng)?shù)腟TTM序列設(shè)計(jì)。與此同時(shí)，植物的轉(zhuǎn)基因效率和載體表達(dá)活性影響著STTM的實(shí)際效果，這也是在使用STTM技術(shù)時(shí)需要考慮的。