鄭文清 張倩 杜亮

（北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，北京 100083）

Small RNA包括微小RNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA），它們在植物的生長、發(fā)育、表觀遺傳、染色體完整、抵御病毒感染，以及對環(huán)境的改變作出響應中扮演著重要的角色［1-4］。其中，miRNA主要通過轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負調(diào)控功能［5］，而siRNA在RNA干擾和轉(zhuǎn)錄基因的沉默中都發(fā)揮著重要的作用［3］。目前為止，隨著許多物種的高通量測序的完成，很多物種的miRNA被鑒定出來［6］。盡管如此，研究miRNA的技術仍然相對匱乏［7］。傳統(tǒng)的研究基因功能方法最典型的特點是依賴于突變體［8］，但是這種方法不適用于miRNA的研究。其原因主要包括：miRNA基因較小、家族成員多、每個miRNA可能靶向調(diào)控多個下游基因等。在人們早期對miRNA功能的研究工作中，主要是通過過表達miRNA或者表達miRNA-resistant的靶標基因［9］，達到調(diào)控miRNA功能的目的。但是，這兩種方式都有缺陷：其中，由于每個miRNA都有多個靶標基因，過表達miRNA基因會導致其所有靶標基因表達水平的下降，因此這些方法不能很好地反映某個特定的miRNA的功能；而對于傳統(tǒng)miRNA-resistant技術，同樣存在靶向性不強的問題。

近年來隨著分子生物學、遺傳學、細胞生物學等學科的發(fā)展，開發(fā)了一種對miRNA功能研究比較有效的技術，即“短串聯(lián)靶標模擬”（Short tandem target mimic，STTM）技術。STTM是一個人工構(gòu)建的非編碼RNA（100 nt左右大?。?，由兩個miRNA互補序列和一段中間序列組成，它可以通過穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化或者病毒介導的瞬時表達系統(tǒng)在植物中表達［10］。通過檢測一些影響STTM表達效率的參數(shù)，可以推導出設計最好的STTM的一般規(guī)則。與之前的幾種技術相比，如“靶標模擬”（Target mimic，TM）［11］、“miRNA sponge”［12-15］和其他一些RNA引 誘 的 類 型 如“tough decoy（TuD）RNAs”［16-17］，該技術可以在體內(nèi)特異地誘導miRNA的降解，且已經(jīng)成功應用于擬南芥［18］、煙草［10］、大豆［19］、番茄［20］、棉花［21］、小麥［22-23］和水稻［24］等的miRNA功能研究中［25］。本文將在介紹這個技術的基礎上，重點對應用范圍和優(yōu)缺點等進行總結(jié)，以期為更好地利用該技術來研究植物miRNA的功能奠定基礎。

1 STTM

1.1 STTM的發(fā)現(xiàn)

STTM最初是以“靶標模擬”現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為基礎建立的。早期研究發(fā)現(xiàn)，當植物處于磷饑餓狀態(tài)時，miR399和一個非蛋白編碼基因IPS1（INDUCE BY PHOSPHATE STARVATION 1）被誘導表達，與此同時，miR399靶基因PHO2的表達量顯著地下降［11］。序列比對顯示了IPS1的RNA和PHO2的mRNA都可以有效地結(jié)合miR399。PHO2mRNA當與miR399結(jié)合時，被特異地切割，進而抑制了PHO2的轉(zhuǎn)錄水平。但是，當IPS1表達量上升時，IPS1RNA與miR399發(fā)生競爭性結(jié)合，阻礙了miR399對PHO2mRNA的切割。因此，IPS1RNA有效地模擬（Target mimic）了PHO2mRNA，作為一個誘餌吸引了miR399進而保護了PHO2的mRNA不被切割降解［11］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，IPS1 RNA與 miR399的結(jié)合序列不同于PHO2mRNA與miR399的結(jié)合序列，在其第10和11位序列之間加了CUA三個額外的堿基，形成了一個凸起的結(jié)構(gòu)。這3個堿基使得IPS1RNA不能被miRNA399切割。運用IPS1RNA的這種特殊的結(jié)構(gòu)，可以阻礙miRNA對mRNA靶序列發(fā)揮作用，間接保護靶基因，這種技術被稱為“靶標模擬”。但是，并非所有的miRNA都能通過TM有效地被阻遏與靶基因的結(jié)合。例如，修飾過的IPS1RNA在植物中阻礙miR166/165的活性，效果不是特別顯著［18］。這可能是由于修飾過的IPS1RNA的結(jié)合活性或者結(jié)構(gòu)存在問題，或者是在植物發(fā)育到一定階段時，被抑制的miR166/165又重新被激活。此外，miR166/165所在家族成員眾多，這些成員由于序列上的相似性可能會與miRNA166/165競爭性結(jié)合IPS1RNA［18］。為了解決這個問題，早期的研究者對模擬序列的結(jié)構(gòu)做了優(yōu)化，并且發(fā)現(xiàn)，當同時引入了兩個串聯(lián)miRNA結(jié)合位點序列時，模擬結(jié)合的效率大大提高，由此建立miRNA靶標模擬技術［18］。

1.2 STTM的結(jié)構(gòu)的設計

STTM含有兩段不能被切割的miRNA結(jié)合位點，中間由一段spacer序列連接（圖1）。這兩段miRNA結(jié)合位點可以是相同的，靶標一個或者一類miRNA；或者不相同，靶標同一家族的不同miRNA。為了使STTM達到一個比較好的效果：第一，不推薦使用兩個不同家族的完全不同的miRNA，這是因為一段miRNA結(jié)合位點不能夠有效地靶標一個miRNA。第二，miRNA結(jié)合位點的第10和11個堿基（成熟miRNA的5'端）之間應該有一個CUA三堿基的凸起，這樣可以保證STTM序列不被miRNA切割。一些miRNA可能恰巧在第10位堿基之后有可以和STTM結(jié)構(gòu)的CUA互補的UAG結(jié)構(gòu)，這可能導致突起位置的轉(zhuǎn)換和STTM的斷裂。在這種情況下，應該使用其他的三堿基結(jié)構(gòu)。第三，spacer序列的長度最好是從48-88 nt，且是富含AT，以便形成一個相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

圖1 STTM結(jié)構(gòu)示意圖［26］

1.3 影響STTM效率的因素

1.3.1 Spacer的序列長度 STTM由兩個miRNA結(jié)合位點和一段spacer序列構(gòu)成。這段連接序列可能可以控制細胞內(nèi)的Dicer酶的活性，因此對于穩(wěn)定STTM的結(jié)構(gòu)起著至關重要的作用。并且這段中間的連接序列的長短對于miRNA調(diào)控靶基因有著比較重要的作用［27-29］。在擬南芥中，分別構(gòu)建了STTM165/166-8、31、48、88和96 nt（后面的數(shù)字表示spacer堿基序列的長度）并導入植物中，通過表型變化的嚴重程度觀察對miR165/166功能的阻礙作用。結(jié)果表明，當spacer序列長度為8 nt時，STTM轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型相似；當增加spacer序列到31 nt、48 nt和88 nt時，隨著spacer序列長度的增加，生長抑制的表型逐漸加重，而spacer序列為96 nt時，轉(zhuǎn)基因植株生長抑制的表型不再加重，表明spacer比較合適的長度是88 nt［24］。由此可見，STTM中spacer序列長度對miRNA的抑制效果有顯著影響。

1.3.2 STTM熱穩(wěn)定性和次級結(jié)構(gòu) Yan等［18］分析了STTM165/166-8、31和48的RNA次級結(jié)構(gòu)。通過RNA折疊分析表明，STTM165/166-8 RNA的結(jié)構(gòu)有-211.7 kcal/mol的dG，相當不穩(wěn)定。STTM165/166-31和48預測有低于-20 kcal/mol的dG，比STTM165/166-8有更高的穩(wěn)定性。因此推測STTM165/166-8的效率低是因為它的低穩(wěn)定性。STTM165/166-31的穩(wěn)定性比48更高，但是它們的效率恰好相反。對它們的折疊結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，STTM165/166-48形成了一個比較穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。總的來說，這些分析表明了STTM轉(zhuǎn)錄本的熱穩(wěn)定性和次級結(jié)構(gòu)都會影響STTM的效率，在設計時要綜合考慮。

1.3.3 啟動子選擇 在個體中表達STTM序列時，可以選擇組成型、組織特異型或者誘導型表達啟動子。大多數(shù)情況下，為了研究miRNA在植物和動物中的全部功能，組成型表達STTM可以揭示出miRNA缺失功能在不同的發(fā)育階段的影響。在這種情況下，RNA聚合酶II如35S或者2×35S、CMV/EF-1a和polⅢ啟動子如U6都可以使用［16，23-24，26］。為了更加準確地研究miRNA的功能，需要組織特異性的或暫時的表達STTM，在這種情況下，可以使用特異的啟動子。但是，當選用組織特異型或者誘導型啟動子時，要注意啟動子效率對STTM調(diào)控效果的影響［18］。

1.4 參與STTM作用過程的核酸外切酶

SDN蛋白家族的核酸外切酶參與了small RNA的降解，可能參與了STTM介導的miRNA降解［30］。為了證實這一想法，2012年Yan等［18］分別在野生型和sdn1-1 sdn2-1擬南芥雙突變體背景下表達STTM165/166-48并觀察其對植株表型的影響。結(jié)果顯示95%的含有STTM165/166-48的雙突變體沒有表現(xiàn)出明顯的表型變化，而90%的含有STTM165/166-48的野生型植株都表現(xiàn)出了明顯的表型。qRT-PCR結(jié)果顯示，兩種背景下的STTM165/166-48的轉(zhuǎn)錄本表達水平相似，但是，突變體背景下的miR165/166的表達水平比野生型的高很多。同時，在sdn1-1 sdn2-1雙突變體背景下表達STTM156/157-48，表型變化也出現(xiàn)類似的結(jié)果。這些研究表明，SDN蛋白家族是STTM得以發(fā)揮作用的重要核酸外切酶［18］。

2 STTM與TM和SP技術比較

MiRNA功能的鑒定通過之前傳統(tǒng)的缺失功能的方法被證明是比較困難的，因為大多數(shù)miRNA家族成員具有功能冗余性。在miRNA沉默技術中，STTM與TM和SP較為相似，都是通過降低內(nèi)源的miRNA表達水平發(fā)揮調(diào)控作用，但又各有特點。

2.1 TM原理以及應用

2007年，F(xiàn)ranco-Zorrilla等［11］在研究擬南芥低磷脅迫響應時發(fā)現(xiàn)了TM現(xiàn)象，并利用該技術研究了miRNA的一些功能。在該研究中，PHO2是miR399的靶基因，miR399通過剪切PHO2基因進而影響基因的表達。IPS1可以與miR399配對結(jié)合，進而影響了miR399與PHO2的配對結(jié)合，增加了PHO2基因的表達，維持了體內(nèi)的磷平衡。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，IPS1的結(jié)構(gòu)即是在miR399的第10和第11個堿基之間多了3個堿基（CUA），正是由于這3個堿基造成了IPS1能夠與miR399結(jié)合但是不能被miR399切割（圖2）。同時，他們根據(jù)IPS1的結(jié)構(gòu)又構(gòu)建了miR156和miR319的TM載體，并且轉(zhuǎn)化了野生型擬南芥，擬南芥表現(xiàn)出比較明顯的表型，miR156和miR319的表達量有一定程度的下降。Todesco等［31］利用TM 技術構(gòu)建了一系列miRNA的載體，進行了擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，為研究miRNA的功能奠定了一定的理論基礎。

2.2 Sponges（SPs）原理及應用

在前人的研究中，證明“miRNA sponges”在動物中對miRNA的抑制效果比較有效［12］。SPs是包含了多個感興趣的miRNA結(jié)合位點的合成轉(zhuǎn)錄本，它的工作原理主要是作為miRNA的誘餌，阻礙目標miRNA與其靶標mRNA的結(jié)合，進而增強mRNA的表達。每個SP內(nèi)部含有2個堿基的錯配，并且每個miRNA結(jié)合位點中間含有4個堿基的連接序列（圖3）。SP中多個結(jié)合位點和多個連接序列增強了SP結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。并且由于SP結(jié)構(gòu)序列較長，因此構(gòu)建和轉(zhuǎn)化比較困難。SP主要運用在動物中，在植物中的研究較少。Reichel等［33］在植物中構(gòu)建了cmSP165/166 和cmSP159載體，轉(zhuǎn)化擬南芥植株，產(chǎn)生了比較明顯的表型。

圖2 IPS1介導的miR399的TM工作原理示意圖［32］

圖3 SP技術的構(gòu)建示意圖［34］

2.3 STTM與TM、SP技術的比較

STTM與TM、SP技術的比較首先從其結(jié)構(gòu)上來說，STTM包含兩個miRNA結(jié)合位點，每個miRNA結(jié)合位點的第10和第11個堿基之間多出3個額外的堿基（CUA），連接序列較長（48-88 nt）。TM包含一個miRNA結(jié)合位點，并且miRNA結(jié)合位點的第10和第11個堿基之間也多出3個額外的堿基（CUA），沒有連接序列，而SPs通常包含4-15個miRNA結(jié)合位點，每個結(jié)合位點內(nèi)部含有2個堿基的錯配，連接序列較短（4 nt）。其次，STTM與TM、SP技術從其作用機制上來說，都是RISC和RNA相互作用誘導miRNA的降解（表1）。

表1 TM、SP和STTM技術的比較

STTM、TM和SP這3個技術均有其優(yōu)點和缺點。由于STTM的結(jié)構(gòu)較短，因此構(gòu)建比較容易，并且由于STTM比TM多一個結(jié)合位點，因此效率較高，特異性較強。另外，STTM技術介導的miRNA的降解過程不可逆，阻礙miRNA的表達較顯著，轉(zhuǎn)基因植株表型穩(wěn)定［18，35］，但是STTM技術不適用于研究低表達豐度的miRNA。TM技術由于其結(jié)構(gòu)較短，因此構(gòu)建也比較容易，但是由于其只有一個miRNA結(jié)合位點，因此不適用于有多個成員的miRNA家族。研究表明，SP技術在動物中的沉默效果較好，但是由于其結(jié)構(gòu)較長，因此構(gòu)建比較困難［12］。

3 STTM在植物中的應用

3.1 STTM在miR165/166研究中的應用

MiR165/166是植物中最豐富的miRNA家族之一，并且影響著包括葉、花、根和維管組織的許多發(fā)育過程。在擬南芥基因組中有2個miR165基 因（miR165a、miR165b）和7個miR166基 因（miR166a-g）［36］。成熟的miR165和miR166基因只在第17個堿基上有C/U的不同。在擬南芥中過表達miRNA165a、miR165b或者miR166a都有相似的表型，說明了它們的功能具有冗余性。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR165/miR166的靶基因包括HD-ZIPⅢ家族的5個成員，分別是PHABULOSA（PHB）/ ATHB14、PHAVOLUTA（PHV）/ ATHB9、INTERFASCICULAR/FIBERLESS/REVOLUTA（IFL1/REV）、INCURVATA4/ CORONA / ATHB15和ATHB8［34］。這些基因調(diào)控許多植物發(fā)育過程，如頂端分生組織和側(cè)生分生組織的形成、葉片的極性、維管組織形態(tài)和花的發(fā)育等過程［37-43］。

在擬南芥中，過表達STTMmiRNA165/166植株的表型與PHB基因的顯性抑制突變體phb-1d相似但更明顯。Small RNA免疫印跡和深度測序都證明了在STTM165/166轉(zhuǎn)化植株中，超過95%的miRNA165/166被 降 解［18］。擬 南 芥 中 過 表 達STTM160和STTM165/166影響葉片的發(fā)育和干旱抗性［44］。在水稻中過表達STTM166，植株葉片卷曲，并且葉片有較小的泡狀細胞和不正常的后壁組織細胞，氣孔導度和蒸騰速率降低，這些表型與過表達miR166-resietent的OsHB4基因的表型是相似的［45］。另一個研究表明，在水稻中導入STTM165/166 后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出葉形彎曲、植株矮化等表型［46］。在番茄中，過表達STTM165/166-31，亦能顯著降低內(nèi)源的miRNA165/166水平，同時增強其靶基因的表達水平［47］。在棉花中，過表達pCLCrVASTTM165/166，導致miRNA165/166表達降低，并造成棉花葉片的卷曲［48］。

3.2 STTM在其他miRNA中研究的應用

2017年，Zhang等［24］通過STTM在水稻中產(chǎn)生了35個miRNA家族的轉(zhuǎn)基因株系，以期改良農(nóng)作物的性狀。在STTM轉(zhuǎn)基因株系中，表現(xiàn)出了許多有價值的農(nóng)業(yè)性狀的改變，包括株高，分蘗數(shù)目，谷物數(shù)量，并且在五代以上都是穩(wěn)定的。其中，STTM398能夠增加花序長度，谷物的數(shù)量和大小；STTM172的水稻轉(zhuǎn)基因株系相比野生型有非常短的莖，導致了封閉的花序和矮小的植株，而且相比野生型有更短的和密度更大的花序；STTM156的轉(zhuǎn)基因植株根的發(fā)育受到影響，表明miRNA156參與了根的發(fā)育調(diào)控［24］。除此之外，在水稻中還產(chǎn)生 了STTM159、STTM160、STTM171、STTM441和STTM1428株系，且均產(chǎn)生了比較明顯的表型［24］。在煙草幼苗中，Liu等［49］通過ZMBJ-CMV-2bN81-STTM載體降低了Nbe-miR165/166和Nbe-miR159的表達，并產(chǎn)生了較明顯的表型。在玉米幼苗中，利用同樣的載體降低了zma-miR167 和 zma-miR482的表達，分別產(chǎn)生了側(cè)根數(shù)目減少和生長遲緩的表型。在番茄中，過表達STTM396的轉(zhuǎn)基因番茄果實及萼片顯著變大，miR396a和miR396b的表達量都顯著下調(diào)，表明miR396對于番茄果實及萼片的大小有調(diào)控作用［50］。在番茄中利用STTM技術降低了miR482b的表達，表明了miR482b對番茄抵抗致病疫霉的負調(diào)控作用［51-52］。STTM9678轉(zhuǎn)基因小麥增強了種子的萌發(fā)率，揭示了miR9678通過產(chǎn)生階段性的siRNA和調(diào)控ABA或者赤霉素信號來影響小麥種子的萌發(fā)［53］。在蒺藜狀苜蓿的根中，利用STTM技術對miRNA進行了失活［54］。STTM393的轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)了對大豆疫霉菌的超敏感，并且異黃酮生物合成基因的表達也急劇下降［55］。在大豆中過表達STTM1507a、STTM1507c、STTM482a、STTM403a、STTM168a、STTM162b和STTM1515a，增強了大豆對花葉病毒的抵抗力［56］。STTM472a轉(zhuǎn)基因楊樹揭示了miR472a參與到對壞死真菌的抗性中［57］。STTM164轉(zhuǎn)基因楊樹相比野生型表現(xiàn)出木質(zhì)部加厚的表型，表明miR164在楊樹次生細胞壁合成過程中的作用［58］。干旱處理的菜豆中過表達STTM1514a，其靶基因NAC700的表達量上調(diào)，并降低了NAC誘導的phasiRNA的表達［59］。大麥中VIGS介導的STTM9683，miR9863a/b.2 和 miR9863c/b.1的表達量降低，Mla1基因表達量上升［60］。

4 展望

miRNA在植物的生長發(fā)育過程以及逆境脅迫響應中發(fā)揮著比較重要的作用，近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展，很多植物的miRNA被鑒定出來，因此研究miRNA的功能顯得尤為重要。研究表明，STTM技術在研究植物miRNA及其家族基因功能中有操作簡便、靶向性強等顯著優(yōu)勢，是未來植物miRNA功能研究的有效技術。并且，由于STTM的結(jié)構(gòu)比較小，因此可以將STTM串聯(lián)起來誘導多個miRNA的降解，這將有力推動miRNA調(diào)控網(wǎng)絡功能以及miRNA之間互作的研究工作。同時，在實際應用中，由于STTM序列的穩(wěn)定性受多個因素控制，如spacer序列的長度，RNA的熱穩(wěn)定性、次級結(jié)構(gòu)等。因此，選擇一種比較穩(wěn)定的STTM結(jié)構(gòu)對研究miRNA的功能顯得尤為重要。研究表明，48-88 nt長度的spacer序列是最理想的，太長序列的spacer可能對STTM的穩(wěn)定性起不到比較明顯的作用，反而會增加轉(zhuǎn)化等的困難，太短長度的spacer序列可能不利于STTM結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。而且在啟動子的選擇上面可能也需要根據(jù)不同的miRNA表達情況來選擇合適的啟動子。此外，植物的MiRNA家族成員比較多，并且成員間往往表現(xiàn)為功能冗余；因此，在使用STTM技術對目標MiRNA家族進行表達干擾時，一般需要清楚地知道目標植物的基因組信息，以便進行精確和恰當?shù)腟TTM序列設計。與此同時，植物的轉(zhuǎn)基因效率和載體表達活性影響著STTM的實際效果，這也是在使用STTM技術時需要考慮的。