鄭文清 張倩 杜亮
(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)
Small RNA包括微小RNA(miRNA)和小干擾RNA(siRNA),它們?cè)谥参锏纳L、發(fā)育、表觀遺傳、染色體完整、抵御病毒感染,以及對(duì)環(huán)境的改變作出響應(yīng)中扮演著重要的角色[1-4]。其中,miRNA主要通過轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能[5],而siRNA在RNA干擾和轉(zhuǎn)錄基因的沉默中都發(fā)揮著重要的作用[3]。目前為止,隨著許多物種的高通量測序的完成,很多物種的miRNA被鑒定出來[6]。盡管如此,研究miRNA的技術(shù)仍然相對(duì)匱乏[7]。傳統(tǒng)的研究基因功能方法最典型的特點(diǎn)是依賴于突變體[8],但是這種方法不適用于miRNA的研究。其原因主要包括:miRNA基因較小、家族成員多、每個(gè)miRNA可能靶向調(diào)控多個(gè)下游基因等。在人們?cè)缙趯?duì)miRNA功能的研究工作中,主要是通過過表達(dá)miRNA或者表達(dá)miRNA-resistant的靶標(biāo)基因[9],達(dá)到調(diào)控miRNA功能的目的。但是,這兩種方式都有缺陷:其中,由于每個(gè)miRNA都有多個(gè)靶標(biāo)基因,過表達(dá)miRNA基因會(huì)導(dǎo)致其所有靶標(biāo)基因表達(dá)水平的下降,因此這些方法不能很好地反映某個(gè)特定的miRNA的功能;而對(duì)于傳統(tǒng)miRNA-resistant技術(shù),同樣存在靶向性不強(qiáng)的問題。
近年來隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,開發(fā)了一種對(duì)miRNA功能研究比較有效的技術(shù),即“短串聯(lián)靶標(biāo)模擬”(Short tandem target mimic,STTM)技術(shù)。STTM是一個(gè)人工構(gòu)建的非編碼RNA(100 nt左右大?。蓛蓚€(gè)miRNA互補(bǔ)序列和一段中間序列組成,它可以通過穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化或者病毒介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在植物中表達(dá)[10]。通過檢測一些影響STTM表達(dá)效率的參數(shù),可以推導(dǎo)出設(shè)計(jì)最好的STTM的一般規(guī)則。與之前的幾種技術(shù)相比,如“靶標(biāo)模擬”(Target mimic,TM)[11]、“miRNA sponge”[12-15]和其他一些RNA引 誘 的 類 型 如“tough decoy(TuD)RNAs”[16-17],該技術(shù)可以在體內(nèi)特異地誘導(dǎo)miRNA的降解,且已經(jīng)成功應(yīng)用于擬南芥[18]、煙草[10]、大豆[19]、番茄[20]、棉花[21]、小麥[22-23]和水稻[24]等的miRNA功能研究中[25]。本文將在介紹這個(gè)技術(shù)的基礎(chǔ)上,重點(diǎn)對(duì)應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)等進(jìn)行總結(jié),以期為更好地利用該技術(shù)來研究植物miRNA的功能奠定基礎(chǔ)。
STTM最初是以“靶標(biāo)模擬”現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)建立的。早期研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)植物處于磷饑餓狀態(tài)時(shí),miR399和一個(gè)非蛋白編碼基因IPS1(INDUCE BY PHOSPHATE STARVATION 1)被誘導(dǎo)表達(dá),與此同時(shí),miR399靶基因PHO2的表達(dá)量顯著地下降[11]。序列比對(duì)顯示了IPS1的RNA和PHO2的mRNA都可以有效地結(jié)合miR399。PHO2mRNA當(dāng)與miR399結(jié)合時(shí),被特異地切割,進(jìn)而抑制了PHO2的轉(zhuǎn)錄水平。但是,當(dāng)IPS1表達(dá)量上升時(shí),IPS1RNA與miR399發(fā)生競爭性結(jié)合,阻礙了miR399對(duì)PHO2mRNA的切割。因此,IPS1RNA有效地模擬(Target mimic)了PHO2mRNA,作為一個(gè)誘餌吸引了miR399進(jìn)而保護(hù)了PHO2的mRNA不被切割降解[11]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),IPS1 RNA與 miR399的結(jié)合序列不同于PHO2mRNA與miR399的結(jié)合序列,在其第10和11位序列之間加了CUA三個(gè)額外的堿基,形成了一個(gè)凸起的結(jié)構(gòu)。這3個(gè)堿基使得IPS1RNA不能被miRNA399切割。運(yùn)用IPS1RNA的這種特殊的結(jié)構(gòu),可以阻礙miRNA對(duì)mRNA靶序列發(fā)揮作用,間接保護(hù)靶基因,這種技術(shù)被稱為“靶標(biāo)模擬”。但是,并非所有的miRNA都能通過TM有效地被阻遏與靶基因的結(jié)合。例如,修飾過的IPS1RNA在植物中阻礙miR166/165的活性,效果不是特別顯著[18]。這可能是由于修飾過的IPS1RNA的結(jié)合活性或者結(jié)構(gòu)存在問題,或者是在植物發(fā)育到一定階段時(shí),被抑制的miR166/165又重新被激活。此外,miR166/165所在家族成員眾多,這些成員由于序列上的相似性可能會(huì)與miRNA166/165競爭性結(jié)合IPS1RNA[18]。為了解決這個(gè)問題,早期的研究者對(duì)模擬序列的結(jié)構(gòu)做了優(yōu)化,并且發(fā)現(xiàn),當(dāng)同時(shí)引入了兩個(gè)串聯(lián)miRNA結(jié)合位點(diǎn)序列時(shí),模擬結(jié)合的效率大大提高,由此建立miRNA靶標(biāo)模擬技術(shù)[18]。
STTM含有兩段不能被切割的miRNA結(jié)合位點(diǎn),中間由一段spacer序列連接(圖1)。這兩段miRNA結(jié)合位點(diǎn)可以是相同的,靶標(biāo)一個(gè)或者一類miRNA;或者不相同,靶標(biāo)同一家族的不同miRNA。為了使STTM達(dá)到一個(gè)比較好的效果:第一,不推薦使用兩個(gè)不同家族的完全不同的miRNA,這是因?yàn)橐欢蝝iRNA結(jié)合位點(diǎn)不能夠有效地靶標(biāo)一個(gè)miRNA。第二,miRNA結(jié)合位點(diǎn)的第10和11個(gè)堿基(成熟miRNA的5'端)之間應(yīng)該有一個(gè)CUA三堿基的凸起,這樣可以保證STTM序列不被miRNA切割。一些miRNA可能恰巧在第10位堿基之后有可以和STTM結(jié)構(gòu)的CUA互補(bǔ)的UAG結(jié)構(gòu),這可能導(dǎo)致突起位置的轉(zhuǎn)換和STTM的斷裂。在這種情況下,應(yīng)該使用其他的三堿基結(jié)構(gòu)。第三,spacer序列的長度最好是從48-88 nt,且是富含AT,以便形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。
圖1 STTM結(jié)構(gòu)示意圖[26]
1.3.1 Spacer的序列長度 STTM由兩個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)和一段spacer序列構(gòu)成。這段連接序列可能可以控制細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶的活性,因此對(duì)于穩(wěn)定STTM的結(jié)構(gòu)起著至關(guān)重要的作用。并且這段中間的連接序列的長短對(duì)于miRNA調(diào)控靶基因有著比較重要的作用[27-29]。在擬南芥中,分別構(gòu)建了STTM165/166-8、31、48、88和96 nt(后面的數(shù)字表示spacer堿基序列的長度)并導(dǎo)入植物中,通過表型變化的嚴(yán)重程度觀察對(duì)miR165/166功能的阻礙作用。結(jié)果表明,當(dāng)spacer序列長度為8 nt時(shí),STTM轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型相似;當(dāng)增加spacer序列到31 nt、48 nt和88 nt時(shí),隨著spacer序列長度的增加,生長抑制的表型逐漸加重,而spacer序列為96 nt時(shí),轉(zhuǎn)基因植株生長抑制的表型不再加重,表明spacer比較合適的長度是88 nt[24]。由此可見,STTM中spacer序列長度對(duì)miRNA的抑制效果有顯著影響。
1.3.2 STTM熱穩(wěn)定性和次級(jí)結(jié)構(gòu) Yan等[18]分析了STTM165/166-8、31和48的RNA次級(jí)結(jié)構(gòu)。通過RNA折疊分析表明,STTM165/166-8 RNA的結(jié)構(gòu)有-211.7 kcal/mol的dG,相當(dāng)不穩(wěn)定。STTM165/166-31和48預(yù)測有低于-20 kcal/mol的dG,比STTM165/166-8有更高的穩(wěn)定性。因此推測STTM165/166-8的效率低是因?yàn)樗牡头€(wěn)定性。STTM165/166-31的穩(wěn)定性比48更高,但是它們的效率恰好相反。對(duì)它們的折疊結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明,STTM165/166-48形成了一個(gè)比較穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)??偟膩碚f,這些分析表明了STTM轉(zhuǎn)錄本的熱穩(wěn)定性和次級(jí)結(jié)構(gòu)都會(huì)影響STTM的效率,在設(shè)計(jì)時(shí)要綜合考慮。
1.3.3 啟動(dòng)子選擇 在個(gè)體中表達(dá)STTM序列時(shí),可以選擇組成型、組織特異型或者誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子。大多數(shù)情況下,為了研究miRNA在植物和動(dòng)物中的全部功能,組成型表達(dá)STTM可以揭示出miRNA缺失功能在不同的發(fā)育階段的影響。在這種情況下,RNA聚合酶II如35S或者2×35S、CMV/EF-1a和polⅢ啟動(dòng)子如U6都可以使用[16,23-24,26]。為了更加準(zhǔn)確地研究miRNA的功能,需要組織特異性的或暫時(shí)的表達(dá)STTM,在這種情況下,可以使用特異的啟動(dòng)子。但是,當(dāng)選用組織特異型或者誘導(dǎo)型啟動(dòng)子時(shí),要注意啟動(dòng)子效率對(duì)STTM調(diào)控效果的影響[18]。
SDN蛋白家族的核酸外切酶參與了small RNA的降解,可能參與了STTM介導(dǎo)的miRNA降解[30]。為了證實(shí)這一想法,2012年Yan等[18]分別在野生型和sdn1-1 sdn2-1擬南芥雙突變體背景下表達(dá)STTM165/166-48并觀察其對(duì)植株表型的影響。結(jié)果顯示95%的含有STTM165/166-48的雙突變體沒有表現(xiàn)出明顯的表型變化,而90%的含有STTM165/166-48的野生型植株都表現(xiàn)出了明顯的表型。qRT-PCR結(jié)果顯示,兩種背景下的STTM165/166-48的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平相似,但是,突變體背景下的miR165/166的表達(dá)水平比野生型的高很多。同時(shí),在sdn1-1 sdn2-1雙突變體背景下表達(dá)STTM156/157-48,表型變化也出現(xiàn)類似的結(jié)果。這些研究表明,SDN蛋白家族是STTM得以發(fā)揮作用的重要核酸外切酶[18]。
MiRNA功能的鑒定通過之前傳統(tǒng)的缺失功能的方法被證明是比較困難的,因?yàn)榇蠖鄶?shù)miRNA家族成員具有功能冗余性。在miRNA沉默技術(shù)中,STTM與TM和SP較為相似,都是通過降低內(nèi)源的miRNA表達(dá)水平發(fā)揮調(diào)控作用,但又各有特點(diǎn)。
2007年,F(xiàn)ranco-Zorrilla等[11]在研究擬南芥低磷脅迫響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)了TM現(xiàn)象,并利用該技術(shù)研究了miRNA的一些功能。在該研究中,PHO2是miR399的靶基因,miR399通過剪切PHO2基因進(jìn)而影響基因的表達(dá)。IPS1可以與miR399配對(duì)結(jié)合,進(jìn)而影響了miR399與PHO2的配對(duì)結(jié)合,增加了PHO2基因的表達(dá),維持了體內(nèi)的磷平衡。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),IPS1的結(jié)構(gòu)即是在miR399的第10和第11個(gè)堿基之間多了3個(gè)堿基(CUA),正是由于這3個(gè)堿基造成了IPS1能夠與miR399結(jié)合但是不能被miR399切割(圖2)。同時(shí),他們根據(jù)IPS1的結(jié)構(gòu)又構(gòu)建了miR156和miR319的TM載體,并且轉(zhuǎn)化了野生型擬南芥,擬南芥表現(xiàn)出比較明顯的表型,miR156和miR319的表達(dá)量有一定程度的下降。Todesco等[31]利用TM 技術(shù)構(gòu)建了一系列miRNA的載體,進(jìn)行了擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化,為研究miRNA的功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
在前人的研究中,證明“miRNA sponges”在動(dòng)物中對(duì)miRNA的抑制效果比較有效[12]。SPs是包含了多個(gè)感興趣的miRNA結(jié)合位點(diǎn)的合成轉(zhuǎn)錄本,它的工作原理主要是作為miRNA的誘餌,阻礙目標(biāo)miRNA與其靶標(biāo)mRNA的結(jié)合,進(jìn)而增強(qiáng)mRNA的表達(dá)。每個(gè)SP內(nèi)部含有2個(gè)堿基的錯(cuò)配,并且每個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)中間含有4個(gè)堿基的連接序列(圖3)。SP中多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和多個(gè)連接序列增強(qiáng)了SP結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。并且由于SP結(jié)構(gòu)序列較長,因此構(gòu)建和轉(zhuǎn)化比較困難。SP主要運(yùn)用在動(dòng)物中,在植物中的研究較少。Reichel等[33]在植物中構(gòu)建了cmSP165/166 和cmSP159載體,轉(zhuǎn)化擬南芥植株,產(chǎn)生了比較明顯的表型。
圖2 IPS1介導(dǎo)的miR399的TM工作原理示意圖[32]
圖3 SP技術(shù)的構(gòu)建示意圖[34]
STTM與TM、SP技術(shù)的比較首先從其結(jié)構(gòu)上來說,STTM包含兩個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),每個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的第10和第11個(gè)堿基之間多出3個(gè)額外的堿基(CUA),連接序列較長(48-88 nt)。TM包含一個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),并且miRNA結(jié)合位點(diǎn)的第10和第11個(gè)堿基之間也多出3個(gè)額外的堿基(CUA),沒有連接序列,而SPs通常包含4-15個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)部含有2個(gè)堿基的錯(cuò)配,連接序列較短(4 nt)。其次,STTM與TM、SP技術(shù)從其作用機(jī)制上來說,都是RISC和RNA相互作用誘導(dǎo)miRNA的降解(表1)。
表1 TM、SP和STTM技術(shù)的比較
STTM、TM和SP這3個(gè)技術(shù)均有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。由于STTM的結(jié)構(gòu)較短,因此構(gòu)建比較容易,并且由于STTM比TM多一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),因此效率較高,特異性較強(qiáng)。另外,STTM技術(shù)介導(dǎo)的miRNA的降解過程不可逆,阻礙miRNA的表達(dá)較顯著,轉(zhuǎn)基因植株表型穩(wěn)定[18,35],但是STTM技術(shù)不適用于研究低表達(dá)豐度的miRNA。TM技術(shù)由于其結(jié)構(gòu)較短,因此構(gòu)建也比較容易,但是由于其只有一個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),因此不適用于有多個(gè)成員的miRNA家族。研究表明,SP技術(shù)在動(dòng)物中的沉默效果較好,但是由于其結(jié)構(gòu)較長,因此構(gòu)建比較困難[12]。
MiR165/166是植物中最豐富的miRNA家族之一,并且影響著包括葉、花、根和維管組織的許多發(fā)育過程。在擬南芥基因組中有2個(gè)miR165基 因(miR165a、miR165b)和7個(gè)miR166基 因(miR166a-g)[36]。成熟的miR165和miR166基因只在第17個(gè)堿基上有C/U的不同。在擬南芥中過表達(dá)miRNA165a、miR165b或者miR166a都有相似的表型,說明了它們的功能具有冗余性。目前研究發(fā)現(xiàn),miR165/miR166的靶基因包括HD-ZIPⅢ家族的5個(gè)成員,分別是PHABULOSA(PHB)/ ATHB14、PHAVOLUTA(PHV)/ ATHB9、INTERFASCICULAR/FIBERLESS/REVOLUTA(IFL1/REV)、INCURVATA4/ CORONA / ATHB15和ATHB8[34]。這些基因調(diào)控許多植物發(fā)育過程,如頂端分生組織和側(cè)生分生組織的形成、葉片的極性、維管組織形態(tài)和花的發(fā)育等過程[37-43]。
在擬南芥中,過表達(dá)STTMmiRNA165/166植株的表型與PHB基因的顯性抑制突變體phb-1d相似但更明顯。Small RNA免疫印跡和深度測序都證明了在STTM165/166轉(zhuǎn)化植株中,超過95%的miRNA165/166被 降 解[18]。擬 南 芥 中 過 表 達(dá)STTM160和STTM165/166影響葉片的發(fā)育和干旱抗性[44]。在水稻中過表達(dá)STTM166,植株葉片卷曲,并且葉片有較小的泡狀細(xì)胞和不正常的后壁組織細(xì)胞,氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率降低,這些表型與過表達(dá)miR166-resietent的OsHB4基因的表型是相似的[45]。另一個(gè)研究表明,在水稻中導(dǎo)入STTM165/166 后,轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出葉形彎曲、植株矮化等表型[46]。在番茄中,過表達(dá)STTM165/166-31,亦能顯著降低內(nèi)源的miRNA165/166水平,同時(shí)增強(qiáng)其靶基因的表達(dá)水平[47]。在棉花中,過表達(dá)pCLCrVASTTM165/166,導(dǎo)致miRNA165/166表達(dá)降低,并造成棉花葉片的卷曲[48]。
2017年,Zhang等[24]通過STTM在水稻中產(chǎn)生了35個(gè)miRNA家族的轉(zhuǎn)基因株系,以期改良農(nóng)作物的性狀。在STTM轉(zhuǎn)基因株系中,表現(xiàn)出了許多有價(jià)值的農(nóng)業(yè)性狀的改變,包括株高,分蘗數(shù)目,谷物數(shù)量,并且在五代以上都是穩(wěn)定的。其中,STTM398能夠增加花序長度,谷物的數(shù)量和大?。籗TTM172的水稻轉(zhuǎn)基因株系相比野生型有非常短的莖,導(dǎo)致了封閉的花序和矮小的植株,而且相比野生型有更短的和密度更大的花序;STTM156的轉(zhuǎn)基因植株根的發(fā)育受到影響,表明miRNA156參與了根的發(fā)育調(diào)控[24]。除此之外,在水稻中還產(chǎn)生 了STTM159、STTM160、STTM171、STTM441和STTM1428株系,且均產(chǎn)生了比較明顯的表型[24]。在煙草幼苗中,Liu等[49]通過ZMBJ-CMV-2bN81-STTM載體降低了Nbe-miR165/166和Nbe-miR159的表達(dá),并產(chǎn)生了較明顯的表型。在玉米幼苗中,利用同樣的載體降低了zma-miR167 和 zma-miR482的表達(dá),分別產(chǎn)生了側(cè)根數(shù)目減少和生長遲緩的表型。在番茄中,過表達(dá)STTM396的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)及萼片顯著變大,miR396a和miR396b的表達(dá)量都顯著下調(diào),表明miR396對(duì)于番茄果實(shí)及萼片的大小有調(diào)控作用[50]。在番茄中利用STTM技術(shù)降低了miR482b的表達(dá),表明了miR482b對(duì)番茄抵抗致病疫霉的負(fù)調(diào)控作用[51-52]。STTM9678轉(zhuǎn)基因小麥增強(qiáng)了種子的萌發(fā)率,揭示了miR9678通過產(chǎn)生階段性的siRNA和調(diào)控ABA或者赤霉素信號(hào)來影響小麥種子的萌發(fā)[53]。在蒺藜狀苜蓿的根中,利用STTM技術(shù)對(duì)miRNA進(jìn)行了失活[54]。STTM393的轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)了對(duì)大豆疫霉菌的超敏感,并且異黃酮生物合成基因的表達(dá)也急劇下降[55]。在大豆中過表達(dá)STTM1507a、STTM1507c、STTM482a、STTM403a、STTM168a、STTM162b和STTM1515a,增強(qiáng)了大豆對(duì)花葉病毒的抵抗力[56]。STTM472a轉(zhuǎn)基因楊樹揭示了miR472a參與到對(duì)壞死真菌的抗性中[57]。STTM164轉(zhuǎn)基因楊樹相比野生型表現(xiàn)出木質(zhì)部加厚的表型,表明miR164在楊樹次生細(xì)胞壁合成過程中的作用[58]。干旱處理的菜豆中過表達(dá)STTM1514a,其靶基因NAC700的表達(dá)量上調(diào),并降低了NAC誘導(dǎo)的phasiRNA的表達(dá)[59]。大麥中VIGS介導(dǎo)的STTM9683,miR9863a/b.2 和 miR9863c/b.1的表達(dá)量降低,Mla1基因表達(dá)量上升[60]。
miRNA在植物的生長發(fā)育過程以及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著比較重要的作用,近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,很多植物的miRNA被鑒定出來,因此研究miRNA的功能顯得尤為重要。研究表明,STTM技術(shù)在研究植物miRNA及其家族基因功能中有操作簡便、靶向性強(qiáng)等顯著優(yōu)勢,是未來植物miRNA功能研究的有效技術(shù)。并且,由于STTM的結(jié)構(gòu)比較小,因此可以將STTM串聯(lián)起來誘導(dǎo)多個(gè)miRNA的降解,這將有力推動(dòng)miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)功能以及miRNA之間互作的研究工作。同時(shí),在實(shí)際應(yīng)用中,由于STTM序列的穩(wěn)定性受多個(gè)因素控制,如spacer序列的長度,RNA的熱穩(wěn)定性、次級(jí)結(jié)構(gòu)等。因此,選擇一種比較穩(wěn)定的STTM結(jié)構(gòu)對(duì)研究miRNA的功能顯得尤為重要。研究表明,48-88 nt長度的spacer序列是最理想的,太長序列的spacer可能對(duì)STTM的穩(wěn)定性起不到比較明顯的作用,反而會(huì)增加轉(zhuǎn)化等的困難,太短長度的spacer序列可能不利于STTM結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。而且在啟動(dòng)子的選擇上面可能也需要根據(jù)不同的miRNA表達(dá)情況來選擇合適的啟動(dòng)子。此外,植物的MiRNA家族成員比較多,并且成員間往往表現(xiàn)為功能冗余;因此,在使用STTM技術(shù)對(duì)目標(biāo)MiRNA家族進(jìn)行表達(dá)干擾時(shí),一般需要清楚地知道目標(biāo)植物的基因組信息,以便進(jìn)行精確和恰當(dāng)?shù)腟TTM序列設(shè)計(jì)。與此同時(shí),植物的轉(zhuǎn)基因效率和載體表達(dá)活性影響著STTM的實(shí)際效果,這也是在使用STTM技術(shù)時(shí)需要考慮的。