孫凱 陳正杰 汪登洋 束茹玉 吳吉 韋凡

（農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036）

內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）是一類可以破壞生物體正常生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的新興污染物，其在低濃度條件下能夠?qū)θ巳航】岛蜕鷳B(tài)安全造成威脅［1-2］。雙酚A（Bisphenol A，BPA）是生態(tài)環(huán)境中最常見(jiàn)的有機(jī)污染物之一，該化合物主要用于合成聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂塑料［3］。目前，美國(guó)環(huán)境環(huán)保局已經(jīng)將BPA列為EDCs，主要是因?yàn)樗軌蚋蓴_生物體內(nèi)天然激素的正常生產(chǎn)、分泌、運(yùn)輸和代謝等過(guò)程［4］。研究指出，濃度范圍在4.38-43.8 μmol/L的BPA能夠?qū)λ锂a(chǎn)生急性毒性，而當(dāng)每立方米水體中BPA濃度低于1 μg時(shí)，其即可以表現(xiàn)出雌激素活性［5］。廢水中BPA的去除方法主要包括物理化學(xué)吸附［6］、芬頓氧化［7］、光催化［8］、臭氧氧化［9］、電化學(xué)降解［10］和生物膜過(guò)濾［11］等。這些技術(shù)已經(jīng)用于處理工業(yè)廢水和城市污水中BPA，但它們具有明顯的缺陷，如價(jià)格高昂、耗時(shí)、副產(chǎn)物毒性高及對(duì)環(huán)境造成二次污染等。

已有報(bào)道指出，微生物酶如錳過(guò)氧化酶［12］、辣根過(guò)氧化物酶［13］、多酚氧化酶［14］和酪氨酸酶［15］等，具有高度專一性，有望徹底消除環(huán)境中微量濃度BPA引發(fā)的動(dòng)物和人群健康風(fēng)險(xiǎn)。漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）屬于一類藍(lán)色胞外含銅多酚氧化酶，廣泛分布于白腐真菌中［16］。該類酶具有催化效率高、底物廣譜和生態(tài)可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在食品加工、紡織染色、紙漿漂白、染料脫色、環(huán)境監(jiān)測(cè)和生物修復(fù)等領(lǐng)域得到普遍應(yīng)用［17-18］。盡管如此，游離態(tài)漆酶的活性和穩(wěn)定性容易受到諸多環(huán)境因素的干擾，如pH、溫度、金屬離子和天然有機(jī)質(zhì)等，從而限制了其在BPA污染廢水中的有效應(yīng)用［19］。近年來(lái)，固定化技術(shù)的快速發(fā)展對(duì)漆酶在BPA污水處理中的大規(guī)模應(yīng)用具有重要的戰(zhàn)略意義［20］。本文總結(jié)了生態(tài)環(huán)境中BPA的潛在來(lái)源及其對(duì)生物體健康的危害，重點(diǎn)闡述了固定化漆酶對(duì)廢水中BPA的降解效能和作用機(jī)制，評(píng)估了酶促反應(yīng)體系中BPA轉(zhuǎn)化副產(chǎn)物的雌激素活性和生物毒性，旨為大規(guī)模應(yīng)用固定化漆酶去除廢水中BPA奠定理論基礎(chǔ)和提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 環(huán)境中BPA的主要來(lái)源和危害

BPA作為全球需求量增長(zhǎng)最快的有機(jī)化工原料之一，主要用于制造黏合劑、聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂涂料、聚氯乙烯熱穩(wěn)定劑和增塑料等［3］。由于BPA在工業(yè)領(lǐng)域的大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致其不可避免的對(duì)野生生物和人類健康構(gòu)成威脅［5，21-22］。環(huán)境中的BPA主要來(lái)源于造紙廠和化工廠的廢物排放、城市污水處理廠的不完全去除、垃圾填埋場(chǎng)的滲濾液外泄和復(fù)合塑料的生物化學(xué)降解等（圖1）。BPA能夠通過(guò)空氣、水源和食物等多種途徑進(jìn)入野生生物體內(nèi)，特別是通過(guò)食物鏈的傳遞被人體吸收和攝取，從而引發(fā)人群健康風(fēng)險(xiǎn)［23-24］。目前，研究者在人體尿液、血清、唾液、羊水和胎盤組織中持續(xù)檢測(cè)出BPA表明，人類長(zhǎng)期暴露于BPA污染環(huán)境中［25］。例如，Song等［26］調(diào)查了垃圾場(chǎng)周邊老年居民血清中BPA含量，其檢測(cè)率高達(dá)65%以上，平均濃度為14.0 nmol/L。

圖1 BPA的主要來(lái)源及其對(duì)生物體的健康危害

圖1總結(jié)了BPA對(duì)生物體造成的主要健康危害。該類污染物進(jìn)入動(dòng)物和人體內(nèi)，可以模擬細(xì)胞內(nèi)天然雌激素的作用機(jī)理，干擾有機(jī)體內(nèi)天然激素的正常合成、釋放和代謝等過(guò)程，即使其在微量濃度也會(huì)對(duì)生物體造成毒害效應(yīng)。例如，環(huán)境濃度下的BPA可導(dǎo)致斑馬魚的胚胎出現(xiàn)心包水腫、卵黃囊腫、脊柱彎曲和尾部彎曲等癥狀［27］；而小鼠暴露在BPA中會(huì)顯著地影響其后代的性別比例，導(dǎo)致幼鼠的雌性化［28］。另有研究指出，BPA能夠影響孕婦分娩過(guò)程，導(dǎo)致新生兒DNA甲基化，從而改變出生嬰兒的某些特定基因表達(dá)［29］；BPA對(duì)男性的影響則是降低其精子的數(shù)量和質(zhì)量［30］。此外，人體接觸過(guò)量的BPA也可能引發(fā)心血管疾病和糖尿病等癥狀［31］。因此，亟需采用有效手段消除環(huán)境中的BPA污染風(fēng)險(xiǎn)。目前，廢水處理廠主要采用物理化學(xué)和生物處理技術(shù)去除廢水中BPA，但是其對(duì)低濃度的BPA轉(zhuǎn)化效率有限［6-10，32］。如何構(gòu)建新型、高效、綠色、環(huán)保的BPA處理方法已經(jīng)成為環(huán)境工作者需要迫切解決的重點(diǎn)難題之一。

2 真菌漆酶介導(dǎo)BPA的去除和轉(zhuǎn)化

漆酶是一種綠色催化劑，普遍存在于細(xì)菌、真菌、高等植物和昆蟲體內(nèi)［33］。報(bào)道表明，漆酶具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、底物廣譜和經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于催化氧化芳香族、脂肪烴、酚類和苯胺類等化合物［16，18，34］。目前，漆酶在工業(yè)領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用主要受限于其分離純化成本較高［19-20］。因此，篩選純化出高產(chǎn)漆酶真菌，并直接利用其胞外分泌的粗漆酶催化降解環(huán)境中的BPA備受矚目［14］。同時(shí)，采用天然或人工合成的氧化還原介質(zhì)作為漆酶和污染物之間的電子穿梭體，可有效增強(qiáng)漆酶對(duì)難降解有機(jī)污染物的去除效率［35-36］。值得注意的是，天然介質(zhì)存在于漆酶粗提取物中，而純化的漆酶需要摻入人工合成介質(zhì)才能明顯提高它的催化效能［19，37］。表1總結(jié)了不同來(lái)源的真菌漆酶對(duì)水體中BPA的去除效率及其生成的主要中間產(chǎn)物。例如，Daassi等［38］指出毛革孔菌（Coriolopsis gallica）漆酶-羥基苯并三唑（HBT）介質(zhì)體系在4 h內(nèi)對(duì)BPA的降解率高達(dá)100%。然而，人工合成介質(zhì)可能對(duì)生態(tài)環(huán)境造成二次破壞，這促使研究者開發(fā)天然介質(zhì)以規(guī)避環(huán)境二次污染、提高漆酶的催化效能。例如，de Freitas等［36］研發(fā)了一種高效、經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保的生物處理技術(shù)，該技術(shù)利用糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）漆酶及其粗漆酶液中的天然介質(zhì)構(gòu)建復(fù)合反應(yīng)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們?cè)? h內(nèi)對(duì)廢水中濃度為0.44和0.88 mmol/L的BPA去除率分別高達(dá)100%和85%。本課題組研究指出，變色栓菌（Trametes versicolor）漆酶在25℃、pH 5.0時(shí)對(duì)5 μmol/L的BPA降解半衰期為70.7 min。這些結(jié)果表明，添加氧化還原介質(zhì)可以顯著促進(jìn)漆酶催化BPA的轉(zhuǎn)化，其中天然介體比人工介質(zhì)更具有成本效益和生態(tài)可持續(xù)性。

表1 真菌漆酶催化氧化BPA的去除效率及其主要中間產(chǎn)物

真菌漆酶催化BPA的轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物包括大分子聚合產(chǎn)物和小分子氧化分解產(chǎn)物，其主要受到漆酶來(lái)源和介質(zhì)種類的影響（表1）。一方面，漆酶能夠催化BPA形成苯氧自由基中間體，隨后這些活性中間體在酶促反應(yīng)位點(diǎn)外發(fā)生共價(jià)耦合，形成BPA二聚體、三聚體、四聚體、低聚物和高聚物［45-46］。聚合產(chǎn)物的形成顯著地降低了母體化合物的雌激素活性和生物毒性，可以通過(guò)后續(xù)的沉淀或過(guò)濾工藝去除［46-47］。另一方面，在漆酶-介質(zhì)反應(yīng)體系中，介質(zhì)起到電子穿梭體的作用，促使漆酶催化氧化BPA的C-C鍵裂解，隨后形成多種小分子氧化分解產(chǎn)物［35，38］。例 如，研 究 者 在 糙 皮 側(cè) 耳（Pleurotus ostreatus）粗漆酶（含天然介質(zhì)）催化的BPA反應(yīng)體系中，共檢測(cè)到13種BPA的芳香族和脂肪族代謝產(chǎn)物，主要包括4-異丙基苯酚、甲基戊-3-酸和4-乙基-2-甲氧基苯酚等，其中某些產(chǎn)物具有與BPA類似的生物毒性效應(yīng)［36］。圖2列舉了真菌漆酶介導(dǎo)BPA發(fā)生自由基耦合和氧化降解反應(yīng)的兩種主要轉(zhuǎn)化途徑。不同來(lái)源的真菌漆酶，其氧化還原電位各不相同（0.4-0.8 V），這些差異顯著地改變了BPA轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物的形成及其相對(duì)含量［48］。需強(qiáng)調(diào)，游離態(tài)漆酶的催化活性易受環(huán)境pH、溫度、有機(jī)分子和無(wú)機(jī)顆粒等多種因素的影響，難以分離純化和循環(huán)再利用，從而限制了其在廢水處理中的實(shí)際應(yīng)用。研究表明，固定化酶技術(shù)有助于漆酶的回收再利用，并可顯著地增加漆酶的穩(wěn)定性和催化效能［49］。因此，該技術(shù)不僅有望實(shí)現(xiàn)漆酶對(duì)BPA的連續(xù)降解，也可以提高漆酶對(duì)BPA的去除效率，從而為大規(guī)模利用漆酶徹底去除廢水中BPA提供重要依據(jù)。

3 固定化漆酶在BPA去除中的應(yīng)用

目前，學(xué)者們主要通過(guò)降低生產(chǎn)成本、提高穩(wěn)定性和實(shí)現(xiàn)回收利用等途徑來(lái)研究固定化漆酶在廢水處理中的應(yīng)用，其中載體的選擇對(duì)漆酶催化效能和穩(wěn)定性起到關(guān)鍵作用［16，50-51］。固定化漆酶的載體主要包括納米材料（如納米ZnO、MnO2和氧化石墨烯）［52-53］、磁性顆粒（如磁性納米Fe3O4和納米花）［54-55］、多孔材料（如活性炭和沸石）［56-57］和高分子材料（如殼聚糖和海藻酸鈉水凝膠）［14，58］等。一方面，載體的比表面積越大，其對(duì)漆酶的固載量越高［59］；另一方面，載體的傳質(zhì)阻力越小，漆酶分子越容易固定在載體孔道內(nèi)部［60］。因此，選擇比表面積大和傳質(zhì)阻力小的載體，不僅有助于在載體表面引入功能基團(tuán)（如羥基、羧基和氨基），也可以使BPA更易接觸漆酶的活性位點(diǎn)并加速產(chǎn)物從孔道中的釋放。常用的固定化技術(shù)包括物理和化學(xué)法，其中物理方法有吸附法和包埋法，化學(xué)方法有共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法［16，61］。由此可見(jiàn)，通過(guò)優(yōu)選固定化載體和改進(jìn)固定化方法，有助于提高酶促反應(yīng)的穩(wěn)定性、催化效能和可操作空間，從而為大規(guī)模利用固定化漆酶處理BPA污染廢水提供有效的參考價(jià)值。

圖2 真菌漆酶催化BPA的自由基耦合和氧化分解途徑

3.1 納米材料固定漆酶對(duì)BPA的去除作用

近年來(lái)，基于納米材料的生物酶固定化技術(shù)普遍引起研究者關(guān)注。納米金屬載體具有比表面積大、性能穩(wěn)定和可重復(fù)使用等特性，這些優(yōu)點(diǎn)不僅有利于增加漆酶催化活性位點(diǎn)與底物分子的結(jié)合，也為漆酶提供了一種生物兼容性和惰性環(huán)境［62-63］。例如，Rani等［52］將Cu2+螯合在納米ZnO（＜ 50 nm）和MnO2（＜ 10 nm）顆粒表面，并通過(guò)金屬親和吸附作用將變色栓菌（Trametes versicolor）漆酶固定在兩種金屬納米粒子上。該方法顯著增強(qiáng)了漆酶的環(huán)境穩(wěn)定性、催化活性及其對(duì)廢水中有機(jī)污染物的去除效果。圖3展示了漆酶在納米金屬氧化物表面的固定化操作流程及其對(duì)廢水中BPA的降解機(jī)理。另有研究指出，納米石墨烯或納米氧化石墨烯具有較大的比表面積、豐富的功能基團(tuán)和良好的生物相容性，同時(shí)也表現(xiàn)出優(yōu)異的耐熱性、耐化學(xué)性和機(jī)械穩(wěn)定性，這些材料獨(dú)特的理化性能可以增強(qiáng)底物分子與固定化漆酶之間的電子轉(zhuǎn)移作用，從而促進(jìn)底物的氧化降解［53，64］。例如，將漆酶固定在石墨烯或氧化石墨烯復(fù)合納米顆粒上，不僅能夠擴(kuò)大漆酶的pH和溫度適應(yīng)范圍，也提高了漆酶的可重復(fù)利用性［65-66］。這些性能的改變有效地促進(jìn)了BPA與漆酶分子之間的電子傳遞，從而有利于廢水中BPA的生物轉(zhuǎn)化。此外，納米靜電紡絲纖維的高孔隙率和比表面積，也能夠確保漆酶的高負(fù)載率，并降低傳質(zhì)阻力，可作為漆酶固定化載體并具有開發(fā)應(yīng)用潛力［67］。在今后的研究中，如何設(shè)計(jì)和構(gòu)建復(fù)合納米載體，以實(shí)現(xiàn)固定化漆酶對(duì)廢水中BPA的高效生物轉(zhuǎn)化，對(duì)促進(jìn)綠色可持續(xù)生態(tài)修復(fù)技術(shù)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

圖3 漆酶在納米金屬氧化物表面的固定化及其對(duì)廢水中BPA的去除機(jī)理

3.2 磁性顆粒固定漆酶對(duì)BPA的降解效能

據(jù)報(bào)道，磁性顆粒對(duì)漆酶的負(fù)載量較大，并可以與底物充分接觸，具有良好的催化性能和易重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)［54，66］。例如，劉莉等［68］以Cu2+為橋基，通過(guò)螯合作用將漆酶固載在乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tet-raacetic acid，EDTA）功能化的磁性顆粒表面，制備固定化漆酶磁性材料。該操作工藝反應(yīng)條件溫和，不會(huì)破壞酶的空間結(jié)構(gòu)，且能夠保持酶的活性和提高蛋白的固載量。目前，研究者［61］主要通過(guò)親和吸附、共價(jià)結(jié)合和交聯(lián)法，將漆酶固定在磁性顆粒表面，其中最常用的磁性粒子為Fe3O4。磁性納米Fe3O4比表面積大、表面羥基豐度高，易于進(jìn)行表面修飾以及與漆酶分子的結(jié)合［63］。同時(shí)，納米級(jí)磁性顆粒具有超順磁性，可以通過(guò)添加外部磁場(chǎng)簡(jiǎn)單地從生物催化反應(yīng)體系中分離。此外，磁性納米顆粒的機(jī)械穩(wěn)定性高、孔隙率低，這些特性有利于降低反應(yīng)中的傳質(zhì)阻力，并提高固定化漆酶的重復(fù)使用率［66，69］。例如，歐陽(yáng)科等［70］制備的磁性納米Fe3O4/石墨烯固定化漆酶對(duì)酸的適應(yīng)能力、耐熱性和貯存穩(wěn)定性均有所提高，該固定化漆酶在18 h內(nèi)對(duì)BPA的去除率高達(dá)82.1%，且循環(huán)使用10次后仍保留80%以上的漆酶活性。圖4總結(jié)了采用交聯(lián)酶聚合體法制備磁性納米Fe3O4微球固定化漆酶的工藝流程［71］，該方法在11 h內(nèi)對(duì)262.7 μmol/L的BPA去除效果為87.3%。另有研究者［55］將氨基功能化的磁性納米顆粒附著在漆酶-無(wú)機(jī)雜化納米花上發(fā)現(xiàn)，該磁性納米花在5 min內(nèi)對(duì)BPA的降解率高達(dá)100%，且具有較長(zhǎng)的保藏周期和優(yōu)異的循環(huán)再利用性能。

圖4 磁性交聯(lián)漆酶聚合體的制備及其對(duì)BPA的去除效果［71］

3.3 多孔材料固定漆酶對(duì)BPA的轉(zhuǎn)化機(jī)制

由于多孔材料如活性炭和沸石的比表面積較大，因此利用多孔材料作為漆酶固定化載體可有效提高單位體積的酶固載量和催化活性［72-73］。與多孔的有機(jī)漆酶載體相比，多孔的無(wú)機(jī)漆酶載體的理化性質(zhì)較穩(wěn)定，孔隙結(jié)構(gòu)更容易控制，并具有良好的生物相容性［61，74］。例如，Nguyen等［56］研究指出，將來(lái)源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的漆酶固定在粒狀活性炭表面，不僅有利于增強(qiáng)漆酶對(duì)環(huán)境pH和溫度的適應(yīng)性，也促使BPA能夠有效地吸附在活性炭顆粒表面并加速漆酶與底物分子之間的電子轉(zhuǎn)移，從而顯著地提高了漆酶對(duì)填料床柱中BPA的去除效率及其循環(huán)再生能力。此外，將漆酶固定在表面改性的無(wú)機(jī)多孔載體上，也能夠強(qiáng)化漆酶對(duì)水體中BPA的去除和轉(zhuǎn)化作用。如圖5所示，采用吸附法將變色栓菌（Trametes versicolor）漆酶固定在改性的脫鋁Y型沸石中，不僅提高了漆酶的固定化產(chǎn)率和效能，也增強(qiáng)了漆酶對(duì)BPA的去除效率（86.7%），反應(yīng)體系中BPA的轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物主要包括對(duì)苯二酚和4-異丙基苯酚［57］。

圖5 漆酶在改性沸石上的固定化率及其對(duì)BPA的降解機(jī)理［57］

3.4 高分子材料固定漆酶的操作工藝及其在BPA轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

天然源的高分子聚合物如殼聚糖和海藻酸鈉水凝膠可提供生物相容性環(huán)境，將生物分子固定在所需的聚合物網(wǎng)絡(luò)中［69，75］。因此，這些無(wú)毒無(wú)害的天然聚合物能夠作為漆酶的固定化載體，提高漆酶的穩(wěn)定性、催化效能和循環(huán)利用率［75］。例如，與游離態(tài)漆酶相比，將漆酶固定在明膠、瓊脂和聚丙烯酰胺基水凝膠中，可以明顯增強(qiáng)漆酶的催化活性、熱穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)特性。此外，水凝膠載體也具有良好的截留效果和吸附性能［76］。Skoronski等［77］研究表明，將來(lái)源于黑曲霉（Aspergillussp.）的漆酶固定在殼聚糖中可以顯著地增強(qiáng)漆酶對(duì)酚類污染物的去除效率。Lassouane等［14］采用戊二醛交聯(lián)法，將絨毛栓菌（Trametes pubescens）粗漆酶包埋在海藻酸鈣小球中，有效地提高了漆酶的固定化產(chǎn)率；該固定化漆酶在2 h內(nèi)對(duì)水溶液中BPA的降解效率高達(dá)99%以上（反應(yīng)條件為87.6 μmol/L BPA、1.5 U/mL漆酶、pH 5.0和30℃），且循環(huán)使用10次后其對(duì)BPA的去除率仍保持在70%以上。另有報(bào)道［78］將Cu2+和Mn2+螯合在負(fù)載殼聚糖的Fe3O4顆粒表面，制備帶正電荷的磁性高分子微球；然后，通過(guò)使帶負(fù)電荷的漆酶結(jié)合在帶正電荷的磁性Fe3O4微球上，該固定化漆酶的活性可達(dá)100%。圖6展示了將天然高分子材料制備的固定化漆酶填充在流化床反應(yīng)器中對(duì)廢水中BPA的去除工藝［40］，該處理技術(shù)有望大規(guī)模的用于連續(xù)高效降解廢水中BPA。

圖6 天然高分子聚合物小球填充的流化床反應(yīng)器示意圖［40］

3.5 酶膜反應(yīng)器連續(xù)高效去除廢水中BPA的工藝流程

與吸附、高級(jí)氧化、電化學(xué)降解和生物轉(zhuǎn)化等方法相比，酶膜反應(yīng)器對(duì)環(huán)境中EDCs的去除效率更高，且該技術(shù)具有生態(tài)友好、易操作和可大規(guī)模應(yīng)用等特點(diǎn)［79-80］。因此，將漆酶固載在酶膜反應(yīng)器中，用于高效、安全的降解廢水中BPA已經(jīng)受到研究者的廣泛關(guān)注。已有資料顯示，漆酶在膜反應(yīng)器中的固定可以顯著地改善酶的負(fù)載率和催化活性，但是也會(huì)造成酶的通透性損失，且無(wú)法避免酶在生物利用過(guò)程中的浸出［81］。近年來(lái)，研究者利用漆酶溶液的反滲透原理合成的雙面生物催化膜，能夠有效改善酶膜反應(yīng)器的性能缺陷，實(shí)現(xiàn)BPA的高效生物轉(zhuǎn)化［82］。該技術(shù)的原理是利用壓力誘導(dǎo)的對(duì)流傳質(zhì)增強(qiáng)漆酶對(duì)BPA的利用率，同時(shí)去除堆積在膜上的BPA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。此外，Nguyen等［83］也開發(fā)出一種新型酶膜反應(yīng)器，用于連續(xù)高效消除廢水中BPA。該技術(shù)采用超濾膜防止漆酶流失，其在連續(xù)催化反應(yīng)體系中對(duì)BPA的去除率為80%，而添加天然介質(zhì)丁香醛可使BPA的去除率高達(dá)95%以上。另有報(bào)道［41］采用共價(jià)結(jié)合法，將來(lái)源于血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus）和變色栓菌（Trametes versicolor）的漆酶固定在多通道陶瓷膜表面；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該酶膜反應(yīng)器在24 h內(nèi)能夠完全去除水體中的BPA。圖7展示了利用漆酶膜反應(yīng)器去除廢水中BPA的工藝流程和作用機(jī)理，該反應(yīng)體系中BPA的主要酶促產(chǎn)物包括BPA氧化降解產(chǎn)物和聚合產(chǎn)物［79］。這些結(jié)果表明，優(yōu)化漆酶的固定化方法不僅能夠提高漆酶的穩(wěn)定性、催化效率和循環(huán)再利用能力，也有望將其大規(guī)模應(yīng)用于廢水中BPA的去除。盡管如此，研究者仍需明確漆酶介導(dǎo)BPA轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物的生態(tài)毒性。

圖7 酶膜反應(yīng)器去除廢水中BPA的作用機(jī)理［79］

4 漆酶催化反應(yīng)中BPA轉(zhuǎn)化中間產(chǎn)物的生態(tài)毒性評(píng)估

漆酶來(lái)源、反應(yīng)條件和介質(zhì)種類等因素可以顯著地影響酶促反應(yīng)中BPA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)量和種類，其中BPA的某些轉(zhuǎn)化中間體產(chǎn)物如4-異丙基苯酚、羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酮、對(duì)苯二酚和2-苯基丙烯等的生態(tài)毒性要高于母體化合物［84-85］。此外，有些BPA芳香環(huán)中間體產(chǎn)物的形成、積累及其協(xié)同作用，甚至能夠誘發(fā)生物體的急性中毒。因此，明確漆酶催化氧化反應(yīng)中BPA及其相關(guān)中間體產(chǎn)物的生態(tài)毒性具有重要意義。例如，de Freitas等［36］調(diào)查指出，與未添加漆酶處理組相比，經(jīng)過(guò)糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）漆酶催化處理的BPA反應(yīng)液對(duì)費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）的急性毒性由85%降低至5%以下；而采用肺形側(cè)耳（Pleurotus pulmonarius）漆酶處理的BPA溶液對(duì)該菌株的急性毒性仍然高達(dá)85%左右，表明反應(yīng)中至少產(chǎn)生了一種與BPA毒性相當(dāng)?shù)闹虚g產(chǎn)物。另有研究者［14］將來(lái)源于絨毛栓菌（Trametes pubescens）的粗漆酶固定在海藻酸鈣微球中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該固定化漆酶催化氧化后的BPA中間產(chǎn)物對(duì)蘿卜種子（Raphanus sativus）沒(méi)有產(chǎn)生毒害作用。由此可見(jiàn)，漆酶催化BPA的氧化降解產(chǎn)物可能仍保留較高的生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)。盡管如此，研究者［46-47］指出利用漆酶催化氧化的另一特性，即通過(guò)自由基介導(dǎo)的C-C和C-O-C共價(jià)耦合途徑形成BPA聚合產(chǎn)物可有效規(guī)避其生物毒性，且這些聚合沉淀物能夠通過(guò)簡(jiǎn)單的離心或過(guò)濾加以去除。因此，優(yōu)選漆酶的固定化方法和工藝處理?xiàng)l件，防控大規(guī)模酶促反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生二次污染問(wèn)題是實(shí)現(xiàn)BPA廢水綠色、安全排放的重要前提保障。

5 總結(jié)與展望

真菌漆酶修復(fù)BPA污染的廢水具有反應(yīng)條件溫和、降解效率高、操作可控和無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為一種理想型的廢水生物處理技術(shù)。然而，真菌漆酶的生物合成和純化費(fèi)用昂貴，難以滿足其在廢水處理中的大規(guī)模應(yīng)用。因此，如何獲得低成本漆酶已經(jīng)成為研究者亟待突破的瓶頸。目前，DNA和蛋白質(zhì)重組技術(shù)有望批量生產(chǎn)漆酶，以實(shí)現(xiàn)其在環(huán)境修復(fù)中的廣泛應(yīng)用。另一方面，pH、溫度、金屬離子和有機(jī)質(zhì)等環(huán)境因素均可影響漆酶在廢水中的催化活性和穩(wěn)定性，如何精心設(shè)計(jì)耐抑制性的漆酶催化反應(yīng)體系至關(guān)重要，這將顯著地提高漆酶對(duì)廢水中BPA的處理效率。

目前，固定化技術(shù)的快速發(fā)展為利用漆酶連續(xù)高效處理BPA污染的廢水提供了可行性。漆酶的固定化可以增強(qiáng)酶的催化活性，提高酶的熱穩(wěn)定性和存儲(chǔ)周期，并有利于酶的循環(huán)再利用。近年來(lái)，利用納米材料、磁性顆粒、多孔材料和高分子聚合物等作為漆酶固定化載體的研究已經(jīng)備受學(xué)者關(guān)注。該類固定化載體不僅具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)屬性，同時(shí)也擁有生物酶的催化功能。然而，研究者仍需從以下兩個(gè)方面進(jìn)行深入探討，進(jìn)而開發(fā)出新型高效固定化漆酶，應(yīng)用于大規(guī)模處理BPA污染廢水。（1）在分子水平上表征漆酶與BPA的作用關(guān)系，明確環(huán)境因子、抑制劑和共污染等外部條件對(duì)漆酶催化BPA的影響；（2）固定化載體與漆酶催化位點(diǎn)的鏈接，確保酶修飾不會(huì)對(duì)漆酶的催化活性和穩(wěn)定性造成影響。