詹紅偉*，劉鑒霄*，劉 昊，張正衍，姚 遠(yuǎn)，張 穎，王嘉琪，王東鑫

(1.蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

1 研究方法

1.1 制備培養(yǎng)基

蘇通培養(yǎng)基(1000m1):硫酸鎂0.5 g；檸檬酸2 g；磷酸氫二鉀0.8 g；L-谷氨酸鈉5 g；檸檬酸鐵胺0.05 g；甘油60 mL，硫酸鋅0.01 g。加超純水溶解完全，氨水調(diào)PH至7.2～7.4，分裝至500 mL三角瓶及200 ml/瓶。

1.2 接種BCG

取活化后的菌種，取適量菌液分別接種到500m1及250ml的蘇通培養(yǎng)基中，衡溫培養(yǎng)至培養(yǎng)基的液面富集一定厚度的菌體層。將培養(yǎng)基中菌體進(jìn)行抽濾收集，后用PBS溶液洗滌兩次，置于試管中在4℃冰箱中進(jìn)行保存。

1.3 BCG表面糖脂萃取

1.3.1 搖床

事先將所需的錐形瓶、玻璃珠以及混合液（氯仿：甲醇=2：1）進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，將試管中所收集的菌體置于已滅菌的錐形瓶，每個(gè)250ml錐形瓶中加入4 g菌體，20g玻璃珠以及100ml的混合溶液，以上所有操作均在無菌操作臺中完成。以8種方案進(jìn)行糖脂提?。簱u床轉(zhuǎn)速：方案一：100 rpm；二：150 rpm；三：200 rpm；四：250 rpm；五：100 rpm；六：150 rpm；七：200 rpm；八：250 rpm。搖床時(shí)間一至四為5 min；五至八為2 min。離心轉(zhuǎn)速各為5000rpm。離心時(shí)間各為10 min。

1.3.2 離心

裝入50 mL的離心管中，并且用天平配平使試管質(zhì)量相近，后進(jìn)行以5000rpm離心10min，使菌體與糖脂分層，收集上清液。

1.3.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮上清液

將離心后的上清液以10X、15X、20X濃縮，置于10 mL試管中。將試管置于-20℃冰箱中保存。經(jīng)薄層色譜染色分析，20倍濃縮。

1.4 BCG表面糖脂的純化

1.4.1 過柱前薄層色譜法分析：用微量移液器量取10 uL在硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)狀點(diǎn)樣，將硅膠板斜放入層析缸中，用氯仿:甲醇:丙酮:乙酸((90:10:6:1)展開劑展開，當(dāng)展開劑前緣距硅膠板上端1 cm處，取出硅膠板吹干。

1.4.2 硅膠柱層析法純化

稱取l00 g 200～300目硅膠粉末，用300 mL氯仿浸泡過夜;勻漿濕法裝柱，調(diào)整流速，并使用250 mL～500 mL的氯仿平衡硅膠柱。

取5 mL上清液進(jìn)行上樣，以氯仿/甲醇混合液為流動(dòng)相，在不同比例氯仿/甲醇梯度洗脫條件下分離總脂，柱層析流速控制在1ml/min。以三種洗脫液進(jìn)行糖脂的洗脫：

①氯仿:甲醇99:1；②氯仿:甲醇9:1；③氯仿:甲醇，96:4

1.4.3 過柱后薄層色譜法分析

將洗脫產(chǎn)物在10xl0 cm規(guī)格硅膠板上點(diǎn)樣，點(diǎn)樣為9 cm左右線狀，待樣品干燥后，斜放入層析缸中，用氯仿:甲醇:丙酮:乙酸((90:10:6:1)展開劑展開，當(dāng)展開劑前緣距硅膠板上端1cm處，取出硅膠板吹干，進(jìn)行碘染，觀察染色效果，并于之前洗脫前染色結(jié)果進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 總脂萃取結(jié)果

BCG大量培養(yǎng)后，收集菌體，并使用高速離心機(jī)分離糖脂和菌體，取上清液，將離心后的上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至10X，15X，20X，再經(jīng)薄層色譜染色分析，得出20X濃縮染色效果最佳。根據(jù)硅膠板上條帶數(shù)可觀察出濃縮后的上清液均有較多成分且含量不一，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)方案二（150 rpm 5 min）的所取得的粗糖脂成分相對較少，可做為后期備選方案。

2.2 糖脂的分離純化結(jié)果

硅膠經(jīng)過氯仿浸泡過夜充分溶脹后，均勻裝柱（柱長30 cm，直徑2 cm），過程中持續(xù)用玻璃棒敲打防止氣泡產(chǎn)生，調(diào)整流速1ml/min，總脂（溶劑為甲醇：氯仿=1：2）上樣5ml左右，依次用50ml氯仿：甲醇=99：1，50ml氯仿：甲醇=9：1，50ml氯仿：甲醇=96:4的有機(jī)體系進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，將方案二的于其余薄層色譜分析圖進(jìn)行對比，其成分相對較少，并且僅有經(jīng)過洗脫液（氯仿：甲醇=9:1）過柱后顯示明顯條帶，其余方案過柱后的三種洗脫液均有不同程度的顯帶，且條帶數(shù)較多，說明其洗脫液成分相對較多，其次再根據(jù)總脂萃取結(jié)果可大致認(rèn)為方案二的BCG糖脂純化方法較優(yōu)于其他方案。

2.4 糖脂成分分析

為了檢測過柱后洗脫液是否存在核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，我們將硅膠柱層析所得24種洗脫液進(jìn)行核酸電泳凝膠分析和蛋白質(zhì)凝膠電泳分析。

2.4.1 核酸凝膠電泳分析結(jié)果

24種洗脫液經(jīng)核酸凝膠電泳分析并進(jìn)行凝膠攝影后得出，圖中熒光亮點(diǎn)即為核酸所在位置，可觀察到第1、6、8、9、15、20、21號試管中有熒光出現(xiàn)，故可分析出方案一、方案三、方案五、方案七中經(jīng)過柱的洗脫液均含核酸雜質(zhì)，又根據(jù)其核酸所在位置與DL 15000 DNA Ladder標(biāo)準(zhǔn)條帶位置對比，可觀察出洗脫液中核酸分子量較大，結(jié)核分歧桿菌的全基因組序列約為4.41Mb，有3942個(gè)開放閱讀框，約4000個(gè)基因；在實(shí)驗(yàn)方案中可能由于轉(zhuǎn)速過高使玻璃珠對菌體的破壞較大，使菌體破裂釋放出核酸分子，后者被EB染色，在紫外光下可發(fā)出熒光，且核酸凝膠電泳僅可分離長度為200dp至50kb的核酸分子，這可以解釋凝膠攝影所出現(xiàn)的核酸位置僅在點(diǎn)樣部位的現(xiàn)象。

2.4.2 SDS-PAGE分析結(jié)果

24種洗脫液經(jīng)蛋白質(zhì)凝膠電泳分析后拍攝后得出，將24種洗脫液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣所跑條帶進(jìn)行對比，可發(fā)現(xiàn)24種洗脫液均無蛋白條帶出現(xiàn)，因此初步確定24種洗脫液中無蛋白質(zhì)雜質(zhì)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過自己創(chuàng)新性提脂方法和前人純化方法相結(jié)合，我們從BCG菌體中分離出來了部分糖脂，早期預(yù)實(shí)驗(yàn)用PBS作為提取糖脂的溶液，但運(yùn)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行上清液濃縮時(shí)，在不破壞糖脂內(nèi)部結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行蒸發(fā)，溫度控制在了60度，但PBS緩沖溶液的沸點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比其高得多，故無法將PBS進(jìn)行濃縮，于是想到了高壓冷凍濃縮儀，我們準(zhǔn)備將提取粗糖脂的溶液改為PBS溶液進(jìn)行，若分離效果明顯，可將濃縮后的上清液進(jìn)行再次濃縮至1ml，待自然揮發(fā)干燥后免疫小鼠，通過檢測小鼠血清中結(jié)核桿菌相關(guān)IgG類抗體產(chǎn)生情況來進(jìn)一步對其免疫活性進(jìn)行研究，若免疫活性較為理想，該糖脂可有望成為亞單位疫苗的新型佐劑，為亞單位疫苗的研究提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

根據(jù)對八種實(shí)驗(yàn)方案結(jié)果進(jìn)行分析，BCG表面糖脂最優(yōu)方案為150 rpmX5 min。