董彥博，張正衍*，程 岳，馬識(shí)婷，吳 怡，艾力西爾·艾斯克爾，周亞麗，王 忠

（蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物中含量最豐富的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、分子和細(xì)胞相互作用中起著關(guān)鍵作用。膠原蛋白具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，即膠原三螺旋結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)由一個(gè)超螺旋的三螺旋組成，它是由三個(gè)左旋的聚線型鏈擰成一個(gè)右旋的三螺旋組成的。這種結(jié)構(gòu)的另一個(gè)特點(diǎn)是，三螺旋的緊密排列要求一級(jí)序列中的每三分之一殘基為Gly，因?yàn)樵谌菪膬?nèi)軸線上沒有任何較大的氨基酸空間。因此，膠原蛋白的第二個(gè)特征是重復(fù)氨基酸序列模式（gly-xaa-yaa）n[1]。另一個(gè)特點(diǎn)是，非甘氨酸的位置經(jīng)常被亞氨基酸脯氨酸占據(jù)。對(duì)于動(dòng)物膠原蛋白，yaa位置的pro殘基，約占所有殘基的10%，通常被prolyl-4-羥化酶（p4h）翻譯后修飾，得到4-羥脯氨酸（hyp）。這種修飾是非常重要的，特別是作為三螺旋良好熱穩(wěn)定性的內(nèi)在要求，同時(shí)也有助于膠原纖維的自締合，以及參與某些受體相互作用[2]。雖然膠原蛋白崽學(xué)術(shù)界被認(rèn)為是一種物質(zhì)，但在人體和其他哺乳動(dòng)物中至少有28種基因的不同類型，它們都具有不同的結(jié)構(gòu)特征。最豐富的膠原是形成膠原纖維的間質(zhì)膠原，特別是I型膠原，存在于所有主要結(jié)締組織中。I型膠原是一種易于獲得和純化的膠原，已成為生物醫(yī)學(xué)和組織工程應(yīng)用的主要膠原。利用重組技術(shù)生產(chǎn)膠原蛋白。重組技術(shù)不僅能夠生產(chǎn)出具有統(tǒng)一產(chǎn)品質(zhì)量的無病產(chǎn)品，還可以產(chǎn)生不常見的膠原類型，而這些稀有的膠原蛋白從組織中直接提取并不實(shí)際。重組技術(shù)通過引入突變殘基、選擇特定結(jié)構(gòu)域制備出具有多個(gè)重復(fù)基序的工程產(chǎn)品和嵌合結(jié)構(gòu)，也有機(jī)會(huì)對(duì)天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改進(jìn)。然而，重組技術(shù)的潛在缺點(diǎn)是，重組膠原也需要功能性p4h的共同表達(dá)，以增強(qiáng)三螺旋穩(wěn)定性。而p4h酶由兩種不同的鏈類型組成，每種鏈的分子質(zhì)量約為65kda。如果膠原三螺旋的穩(wěn)定性較低，則產(chǎn)品為變性膠原和明膠，明膠只有單鏈組成，無法折疊成天然的三螺旋結(jié)構(gòu)。此外，雖然重組技術(shù)可以用于實(shí)驗(yàn)室樣品的小規(guī)模生產(chǎn)，但對(duì)于商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，仍然存在控制工藝和成本評(píng)估方面的問題。

此外，基于轉(zhuǎn)基因生物的其他系統(tǒng)也相繼出現(xiàn)。目前，利用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)膠原蛋白。另一個(gè)適合于纖維蛋白的系統(tǒng)是在轉(zhuǎn)基因家蠶的繭中生產(chǎn)重組人Ⅲ型前膠原。轉(zhuǎn)基因植物中的膠原蛋白生產(chǎn)也得到了發(fā)展，似乎提供了成本效益高、商業(yè)化的結(jié)果。最初的報(bào)告從種子中的發(fā)酵物中產(chǎn)生未經(jīng)羥基化或羥基化不良的膠原蛋白。在生產(chǎn)系統(tǒng)中引入p4h對(duì)于優(yōu)質(zhì)的膠原蛋白產(chǎn)品是必要的。最近，利用p4h也產(chǎn)生了異源三聚體膠原蛋白，這種方法具有可商業(yè)化的前景。重組系統(tǒng)可能還有更多的優(yōu)點(diǎn)，但目前依然停留在實(shí)驗(yàn)室水平上。

重組細(xì)菌膠原：一個(gè)新興系統(tǒng)

膠原蛋白被認(rèn)為與多細(xì)胞動(dòng)物組織有關(guān)。在最近的一段時(shí)間里，在其他物種中出現(xiàn)了類膠原分子的發(fā)現(xiàn)，在一些真菌、病毒和噬菌體中存在（gly-xaa-yaa）n重復(fù)序列。然而，最有趣的是，在細(xì)菌和正在出現(xiàn)的大量細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了許多類膠原結(jié)構(gòu)。在化膿性鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)具有膠原樣重復(fù)序列的基因，這是一種毒力因子。隨后，從同一物種中鑒定出第二個(gè)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的類膠原基因。生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究表明兩者都具有典型的膠原三螺旋結(jié)構(gòu)。

令人驚訝的是，這些膠原蛋白在哺乳動(dòng)物體溫附近都是穩(wěn)定的，融化溫度分別為36.4℃和37.6℃，不存在任何羥脯氨酸。

細(xì)菌膠原序列可能是真核生物水平基因轉(zhuǎn)移到細(xì)菌的結(jié)果。然而，無論基因起源如何，很明顯，一系列的結(jié)構(gòu)、功能和分子相互作用已經(jīng)進(jìn)化并建立起來。對(duì)病原菌的少數(shù)類膠原結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入研究，表明膠原基序通常與細(xì)菌的外膜有關(guān)，并可能與宿主相互作用，以協(xié)助入侵或幫助病原體逃避宿主免疫系統(tǒng)。例如，這種結(jié)合可以是與整合素受體或其他細(xì)胞外基質(zhì)分子的結(jié)合，介導(dǎo)病原體被人類細(xì)胞內(nèi)化。

開發(fā)細(xì)菌膠原蛋白作為一種新的醫(yī)學(xué)材料的另一個(gè)好處是可以很容易地大量生產(chǎn)。毫無疑問，這部分是因?yàn)榧?xì)菌膠原蛋白比人原纖維膠原蛋白序列短。據(jù)報(bào)道，使用高細(xì)胞密度策略和延長的24小時(shí)生產(chǎn)時(shí)間，化膿鏈球菌Scl2構(gòu)建體的最高產(chǎn)量可達(dá)19 g / L。 該構(gòu)建體包含N端非膠原結(jié)構(gòu)域，但是這仍然給出了約14 g / L的膠原結(jié)構(gòu)域計(jì)算產(chǎn)量。良好的發(fā)酵產(chǎn)量仍然需要與簡單有效的下游純化方案相匹配。 對(duì)于商業(yè)生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)室純化方案（例如帶有His6-tag的固定化金屬親和色譜法和其他較小規(guī)模的色譜系統(tǒng)）不適用?？傊?，缺乏細(xì)胞毒性和免疫原性，生產(chǎn)和純化的容易性足以表明細(xì)菌膠原蛋白有望用于生物醫(yī)學(xué)材料。然而，重組技術(shù)也提供了機(jī)會(huì)，使結(jié)構(gòu)易于適應(yīng)以賦予確定的功能或新功能。一些細(xì)菌膠原蛋白已經(jīng)鑒定出內(nèi)源性細(xì)胞結(jié)合域?！翱瞻住笔侵缚梢杂靡粋€(gè)或多個(gè)定義的功能來設(shè)計(jì)和制造分子。通過改變現(xiàn)有的螺旋結(jié)構(gòu)域或通過插入額外的三螺旋基序，各種團(tuán)體已經(jīng)對(duì)此進(jìn)行了探索。基于僅在人類I型膠原蛋白中發(fā)現(xiàn)的大量生物學(xué)域，更不用說在膠原蛋白中增加其他功能的機(jī)會(huì)了，更不用說從眾多其他膠原蛋白類型和相關(guān)的三螺旋蛋白中出現(xiàn)的生物學(xué)域了。另外，可以像其他蛋白質(zhì)一樣，將非三螺旋結(jié)合基序（例如RGD）重組（或在整個(gè)化學(xué)過程中）添加到CL結(jié)構(gòu)域的N端或C端。相似的非三重螺旋序列添加還允許開發(fā)具有定義的特定生物學(xué)功能的其他新分子。最近，已證明向化膿性鏈球菌CL結(jié)構(gòu)域的C末端添加絲狀基序（GAGAGS）n能夠與絲質(zhì)底物結(jié)合，從而提供了開發(fā)更復(fù)雜的復(fù)合結(jié)構(gòu)的機(jī)會(huì)。

生物技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵考慮因素是，可以從新的細(xì)菌膠原基材料中開發(fā)出什么產(chǎn)品？像哺乳動(dòng)物的膠原蛋白一樣，在生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品中肯定會(huì)有機(jī)會(huì)，將新的膠原蛋白用作涂層或制成特定的設(shè)備，以提供用于特定用途的增強(qiáng)產(chǎn)品。例如，作為涂層，細(xì)菌膠原可以被生物工程化以引入離散的整聯(lián)蛋白結(jié)合序列GLPGER，GFPGER或GFPGEN，以靶向特定的整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域（α1I結(jié)構(gòu)域或α2I結(jié)構(gòu)域）。這樣提供的涂層基質(zhì)可以區(qū)分內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞粘附，同時(shí)避免任何血小板凝集，而血小板凝集對(duì)于血管假體和其他心血管技術(shù)具有特殊的應(yīng)用。如設(shè)計(jì)的生物活性水凝膠和其他形式（例如海綿）產(chǎn)生細(xì)菌膠原的能力進(jìn)一步擴(kuò)展了潛在的生物醫(yī)學(xué)和組織工程應(yīng)用。最近的研究表明，當(dāng)使用適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定和干燥存儲(chǔ)策略時(shí)，也可以為此類產(chǎn)品獲得足夠的保質(zhì)期。

總結(jié)與展望

除了重組技術(shù)和生物工程細(xì)菌膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)和組織工程應(yīng)用中的前景的當(dāng)前實(shí)例外，未來還會(huì)出現(xiàn)其他中藥的發(fā)展。但是內(nèi)在穩(wěn)定性的進(jìn)一步增強(qiáng)是未來發(fā)展的重要突破點(diǎn)。這可能是由于發(fā)現(xiàn)了更穩(wěn)定的分子（例如高穩(wěn)定性，Tm = 42℃，在噬菌體膠原蛋白中發(fā)現(xiàn)了膠原蛋白）或通過對(duì)序列進(jìn)行了修改而結(jié)合了對(duì)不同序列特征的現(xiàn)有理解而引起的，包括靜電相互作用，可以增強(qiáng)穩(wěn)定性。增加穩(wěn)定性的另一種選擇是添加Hyp，該產(chǎn)品目前未包含在大腸桿菌生產(chǎn)系統(tǒng)中。以前，已經(jīng)提出可以通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入修飾的氨基酸Hyp來實(shí)現(xiàn)，盡管摻入的效率可能受到限制并且對(duì)序列中的Yaa位置沒有特異性。然而，最近，已經(jīng)描述了在大腸桿菌中發(fā)酵期間允許膠原結(jié)構(gòu)域的Yaa-位置特異性翻譯后羥基化的系統(tǒng)，并且該系統(tǒng)對(duì)于短肽長度的膠原底物是有效的。這種方法對(duì)細(xì)菌膠原蛋白的使用可能會(huì)受到其較大尺寸和Xaa位置Pro比例較高的限制。 另一個(gè)潛在的發(fā)展領(lǐng)域是嵌合結(jié)構(gòu)。 這些可能包括不同細(xì)菌膠原蛋白成分的復(fù)合結(jié)構(gòu)，例如，使用不同物種的折疊結(jié)構(gòu)和膠原蛋白結(jié)構(gòu)域，或者使用不同膠原蛋白結(jié)構(gòu)域，或者包含細(xì)菌膠原蛋白和不同蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，例如絲綢，彈性蛋白 或其他膠原蛋白。還存在進(jìn)一步使細(xì)菌膠原蛋白核心蛋白功能化的機(jī)會(huì)，以允許選擇性地對(duì)一種或多種肽或非肽分子之一進(jìn)行簡單而復(fù)雜的束縛，以實(shí)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)材料的既定開發(fā)。

膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)設(shè)備中已經(jīng)確立了重要地位，在生物醫(yī)學(xué)設(shè)備中，已經(jīng)開發(fā)了包括制造的組織和可溶解的膠原蛋白格式在內(nèi)的不同形式。這些產(chǎn)品已成功用于許多不同的臨床應(yīng)用中。 然而，在某些情況下，例如用制造的基于組織的硬腦膜替代物，已經(jīng)觀察到不幸的不良后果，在該示例中由于疾病傳播導(dǎo)致死亡。該示例以及疾病傳播帶來的其他潛在問題，意味著仍然需要考慮使用基于天然膠原的材料和設(shè)備。 在商業(yè)重組生產(chǎn)人類膠原蛋白方面已取得顯著進(jìn)展。但是，已經(jīng)在大腸桿菌中鑒定并產(chǎn)生重組非動(dòng)物（細(xì)菌）膠原蛋白的快速興起的技術(shù)引入了令人興奮的新膠原蛋白選項(xiàng)，可以輕松地針對(duì)特定的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用對(duì)其進(jìn)行定制。這些定制的膠原蛋白將為在醫(yī)療設(shè)備，可植入材料以及潛在地用作干細(xì)胞支架等更多樣化的應(yīng)用鋪平道路，僅舉幾例這些重組細(xì)菌膠原蛋白的用途。為了實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，需要在中試規(guī)模（例如500 L批量）下進(jìn)行高發(fā)酵產(chǎn)量和直接純化過程的未來演示，以顯示可擴(kuò)展性和評(píng)估過程的經(jīng)濟(jì)性。 中試規(guī)模的批次還將促進(jìn)大量材料的生產(chǎn)，然后可將其用于一般動(dòng)物模型中的更廣泛的生物學(xué)評(píng)估和應(yīng)用開發(fā)，然后再定義用于特定生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的功能性動(dòng)物模型。