楊群,肖文濤
九江市食品藥品檢驗(yàn)所,江西 九江 332000
酊劑系指將原料藥物用規(guī)定濃度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液體制劑,微生物污染情況是重要的藥品質(zhì)控指標(biāo)[1,2]。按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)四部規(guī)定,非無(wú)菌產(chǎn)品需做微生物限度檢査,且需采用通過(guò)方法適用性試驗(yàn)的檢查方法。本研究中兩種酊劑復(fù)方補(bǔ)芷酊、養(yǎng)血首烏酊由不同中藥原料經(jīng)乙醇提取制成,由于提取溶劑為75%的乙醇,以及中藥原料固有成分的復(fù)雜性,存在不同程度的抑菌作用。依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107 要求,制劑進(jìn)行微生物限度檢查前應(yīng)先消除其抑菌活性,避免試驗(yàn)干擾。本文對(duì)兩種酊劑需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌進(jìn)行試驗(yàn),通過(guò)適用性試驗(yàn)研究,消除制劑的抑菌性,建立準(zhǔn)確可靠的微生物限度檢查方法。
LMQ.C型高壓蒸汽滅菌器(山東新華儀器有限公司);YP1002N型電子天平(上海菁海儀器有限公司);BSC-1304IIB2型生物安全柜(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司);LRH-150型細(xì)菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);SPX-150型霉菌培養(yǎng)箱(揚(yáng)州慧科科學(xué)儀器有限公司);GHP-9162型生化培養(yǎng)箱(揚(yáng)州慧科科學(xué)儀器有限公司)。
復(fù)方補(bǔ)芷酊(批號(hào):20200110、20200122、20200205)、養(yǎng)血首烏酊(批號(hào):20200106、20200117、20200203),均由景德鎮(zhèn)市皮膚病醫(yī)院提供。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào):190329),胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):190518),沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):190402),pH 7.0 氯化鈉緩沖蛋白胨水(批號(hào):200319),均為北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn);溴化十六烷基三甲胺瓊脂(批號(hào):1073801),甘露醇氯化鈉瓊脂(批號(hào):3102307)均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn)。
枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501(批 號(hào):200411),金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003(批號(hào):200305),銅綠假單胞菌CMCC(B)10104(批號(hào):200317),白色念珠菌CMCC(F)98001(批號(hào):201108),黑 曲 霉CMCC(F)98003 (批號(hào):200514),均由北京三藥技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。
復(fù)方補(bǔ)芷酊和養(yǎng)血首烏酊均為皮膚給藥制劑,其微生物限度標(biāo)準(zhǔn)如下:需氧菌總數(shù)不超過(guò)100 cfu/mL(1 mL或1 g可接受的最大菌數(shù)為200 cfu),霉菌和酵母菌總數(shù)不超過(guò)10 cfu/mL(1 mL或1 g可接受的最大菌數(shù)為20 cfu),不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌(1 mL)。
取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉凍干物,分別吸取復(fù)溶液1 mL加入菌株西林瓶中,蓋上瓶蓋,靜置5~10 s,渦旋震蕩5~10 s。吸取1 mL加入9 mL無(wú)菌生理鹽水,混勻,逐級(jí)進(jìn)行10倍稀釋,最終使其含菌數(shù)約5 000~10 000 cfu/mL。
取供試品10 mL,置錐形瓶中,加無(wú)菌生理鹽水至100 mL,震蕩混勻,作為1∶10供試液。
2.3.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組:取供試液9.9 mL,加入適宜濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL,混勻,使每1 mL供試品中含菌量不大于100 cfu。取1 mL注入平皿,立即注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,置35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24~72 h逐日觀察結(jié)果。
供試品對(duì)照組:取上述供試液,以稀釋液代替菌液,同實(shí)驗(yàn)組操作,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。
菌液對(duì)照組:取相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。
2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組:取上述試液9.9 mL,加入適宜濃度的試驗(yàn)菌液0.1 mL,混勻,使每1 mL供試品中含菌量不大于100 cfu。取1 mL注入平皿,立即注入沙氏瓊脂培養(yǎng)基,置25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24~120 h逐日觀察結(jié)果。供試品對(duì)照組:取上述供試液,以稀釋液代替菌液,同實(shí)驗(yàn)組操作,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。菌液對(duì)照組:取相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。
按如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收比例:
表1 試驗(yàn)組加菌的回收率 %
由表1可見(jiàn),平皿法對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌有極強(qiáng)的抑制作用,選用薄膜過(guò)濾法對(duì)需氧菌進(jìn)行試驗(yàn)。
2.5.1 實(shí)驗(yàn)組取供試液1 mL,采用薄膜過(guò)濾法,每筒用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL分3次沖洗,在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗(yàn)菌,濾干,立即貼膜與胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,置35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24~72 h逐日觀察結(jié)果。
2.5.2 供試品對(duì)照組取上述供試液,以稀釋液代替菌液,同實(shí)驗(yàn)組操作,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。
2.5.3 菌液對(duì)照組取相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。
表2 試驗(yàn)組加菌的回收率 %
由表2可見(jiàn),薄膜過(guò)濾法可消除制劑的抑菌作用,選用薄膜過(guò)濾法對(duì)需氧菌進(jìn)行試驗(yàn)。
取復(fù)方補(bǔ)芷酊和養(yǎng)血首烏酊各3批,需氧菌總數(shù)按照薄膜過(guò)濾法操作步驟,霉菌和酵母菌總數(shù)按照平皿法操作步驟,對(duì)6批樣品進(jìn)行微生物限度檢查,結(jié)果顯示,樣品中需氧菌總數(shù)均小于10 cfu/mL、霉菌和酵母菌總數(shù)均小于10 cfu/mL,符合相關(guān)規(guī)定。
取復(fù)方補(bǔ)芷酊和養(yǎng)血首烏酊各3批,金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌按照薄膜過(guò)濾法操作步驟,結(jié)果顯示,樣品中金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌均未檢出。
兩種制劑采用平皿法檢驗(yàn)時(shí),對(duì)需氧菌有明顯抑菌作用,金色葡萄球菌和銅綠假單孢菌回收率遠(yuǎn)低于70%,對(duì)霉菌則無(wú)影響。該兩種醫(yī)院制劑由75%乙醇提取制成,經(jīng)測(cè)定制劑乙醇實(shí)際濃度60%~70%,乙醇溶劑20%即具有不同程度的抑菌作用。同時(shí)中藥成分復(fù)雜,自身也存在不同程度的抑菌作用,其抗菌作用不僅體現(xiàn)在方劑有效成分對(duì)細(xì)菌直接抑殺,同時(shí)還表現(xiàn)在方劑中各味藥多種成分相互作用的綜合效應(yīng)上[3]??紤]兩種制劑均有一定的抑菌性,且易溶于水,采用薄膜過(guò)濾法可快速、有效地去除藥品中所含有的抑菌性,提高檢驗(yàn)的效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性[4],而平皿法相對(duì)簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì),微生物檢驗(yàn)時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況采用不同稀釋級(jí)的平皿法或薄膜過(guò)濾法檢測(cè)[5]。
本研究根據(jù)其對(duì)不同菌種的抑菌特性,可采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定需氧菌,平皿法測(cè)定霉菌及酵母菌,結(jié)果可靠,回收率均達(dá)到0.5~2.0。建立了可靠的微生物檢查方法,消除干擾,為含抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)的研究提供參考和研究思路,進(jìn)一步保證制劑的檢測(cè)可靠性和科學(xué)性。