陳思睿，唐琳琳，馮建文，孫麗娜，王金玲,4,

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.呼倫貝爾眾合源農(nóng)業(yè)科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000；3.大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 大連 116036；4.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

水果中相當(dāng)一部分干物質(zhì)是有機(jī)酸，不同種類(lèi)的水果中有機(jī)酸種類(lèi)和含量差異很大[1]。紅樹(shù)莓有機(jī)酸含量高且主要是檸檬酸[2]，導(dǎo)致紅樹(shù)莓產(chǎn)品口感不佳，糖酸比不協(xié)調(diào)，限制了紅樹(shù)莓的開(kāi)發(fā)利用。相關(guān)研究表明，水果型飲料中高濃度的有機(jī)酸和低pH值對(duì)于人牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)具有腐蝕作用[3-4]。因此，采用有效方法降低紅樹(shù)莓汁的檸檬酸含量，提高pH值，保留活性成分并形成良好風(fēng)味，成為了開(kāi)發(fā)紅樹(shù)莓產(chǎn)品的研究重點(diǎn)。

果汁降酸的方法主要包括化學(xué)降酸、物理降酸、生物降酸。化學(xué)降酸是通過(guò)添加降酸劑進(jìn)行降酸，效果明顯，操作簡(jiǎn)單，但會(huì)對(duì)原料成分、色澤、風(fēng)味和穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響。常用物理降酸法有離子交換樹(shù)脂降酸法、電滲析降酸法、低溫冷凍降酸法等，主要是針對(duì)酒石酸的降酸[5]。生物降酸是指微生物以有機(jī)酸為碳源，利用并分解有機(jī)酸，從而達(dá)到降酸目的；一種是蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵法[6-7]，不適用于檸檬酸降酸；另一種采用酵母菌發(fā)酵，使得有機(jī)酸通過(guò)相關(guān)代謝降解[5]。何志剛等[8]從自然發(fā)酵的枇杷酒和刺葡萄酒中分離出2 株釀酒酵母菌，應(yīng)用于枇杷酒和葡萄酒發(fā)酵，分別使總酸下降了16.60%、11.07%和13.76%、8.59%。

目前，對(duì)于降低高酸果汁中檸檬酸的菌株及其接種后對(duì)果汁有機(jī)酸變化影響的研究較少。本研究從紅樹(shù)莓果園泥土和紅樹(shù)莓鮮果中篩選降酸效果最好的菌株，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化，利用生理生化測(cè)定和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列測(cè)定對(duì)降酸菌株進(jìn)行鑒定，旨在為降低高檸檬酸果汁酸度及菌株后續(xù)的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

采集哈爾濱阿城區(qū)紅樹(shù)莓種植園地表下5～10 cm處土壤和紅樹(shù)莓鮮果作為樣品。取土壤2 g和適量紅樹(shù)莓鮮果分別加到盛有100 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中，并加入8～12 粒無(wú)菌玻璃珠，室溫150 r/min振蕩20 min，取出靜置得上清液。

紅樹(shù)莓購(gòu)自黑龍江省尚志市，品種為秋福，速凍處理后運(yùn)回東北林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室凍藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[9]；酵母生孢子培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[10]；孟加拉紅培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；檸檬酸培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g，KH2PO42.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，酵母膏0.5 g，檸檬酸20 g，溶于1 L蒸餾水中，取100 mL配制溶液分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，檸檬酸加入200 mL蒸餾水中，其他成分溶于800 mL蒸餾水中，加瓊脂粉25 g，分別在121 ℃滅菌20 min，冷卻到50～60 ℃，混勻后倒平板[11]。

1.1.3 試劑

酵母菌鑒定生化管 上海江萊生物科技有限公司；檸檬酸、L-蘋(píng)果酸、α-酮戊二酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純）賽默飛世爾（中國(guó)）有限公司；DNA膠回收試劑盒、真菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；常規(guī)藥品試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；PHS-3C型pH酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1FD型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YJ-2005M型生物顯微鏡 寧波天宇光電科技有限公司；DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；5030-PVL型高壓滅菌鍋 長(zhǎng)春百奧生物儀器有限公司；Verity 96well型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；FR-980A型凝膠成像儀 上海復(fù)日科技有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng)；1260 Infinity II液相色譜儀美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹(shù)莓果汁預(yù)處理

紅樹(shù)莓凍果自然解凍后，榨汁機(jī)打漿1 min，在水浴鍋中進(jìn)行酶解，酶解條件為50 ℃、2 h，果膠酶（40 000 U/g）添加量為0.02%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。酶解結(jié)束后，置于90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，經(jīng)8 層紗布過(guò)濾取果汁，置于滅菌錐形瓶中，巴氏殺菌后冷卻，待用[12-13]。

1.3.2 菌種篩選和分離純化

取1.1.1節(jié)預(yù)處理的上清液5 mL，接入檸檬酸質(zhì)量濃度為2 g/L且以檸檬酸為唯一碳源的錐形瓶中，在裝液量100 mL/250 mL、28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。以同樣條件依次將所培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)5 次，檸檬酸質(zhì)量濃度由4、8、12、16 g/L逐漸遞增到20 g/L；通過(guò)初篩和復(fù)篩，選出對(duì)檸檬酸具有較好降酸效果的菌株，挑取單菌落重復(fù)平板劃線(xiàn)純化培養(yǎng)[4,11]。

1.3.3 降酸菌降酸效果

將分離到的菌株在裝液量100 mL/250 mL、28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h，制成種子液，活菌數(shù)為8×107CFU/mL，以接種量4%（體積分?jǐn)?shù)）接種于檸檬酸液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝液量為50 mL/250 mL，28 ℃靜置發(fā)酵8 d。發(fā)酵期間，每1 d取樣測(cè)定總酸含量，比較菌株降酸能力，選擇降酸速度快和降酸量高的菌株。

將上述降酸效果較好菌種的種子液，以接種量4%接種于1.3.1節(jié)制得的紅樹(shù)莓果汁中，果汁裝液量為50 mL/250 mL，以未接菌的紅樹(shù)莓果汁作為對(duì)照，28 ℃靜置發(fā)酵8 d，發(fā)酵期間，每1 d取樣測(cè)定pH值和總酸含量，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)紅樹(shù)莓果汁中有機(jī)酸進(jìn)行定量和定性分析，驗(yàn)證酵母菌的降酸效果。

1.3.4 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

進(jìn)行平板培養(yǎng)和菌體染色鏡檢，觀(guān)察菌落的生長(zhǎng)特征和菌株的形態(tài)特征。

菌落培養(yǎng)特征：將菌液稀釋涂布于麥芽糖平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀(guān)察菌落形態(tài)。經(jīng)美藍(lán)染色后[14]，顯微鏡觀(guān)察菌株細(xì)胞形態(tài)及芽殖方式。采用芽孢染色法，觀(guān)察菌株子囊孢子形狀及每個(gè)子囊內(nèi)子囊孢子的數(shù)目[8]。

液體培養(yǎng)基培養(yǎng)特征：將菌株活化后挑取單菌落接種于100 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀(guān)察液體培養(yǎng)基中菌體培養(yǎng)狀態(tài)。

1.3.5 菌株生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[15-16]的方法進(jìn)行降酸菌株的糖發(fā)酵、同化碳源、同化氮源實(shí)驗(yàn)等生理生化鑒定。

1.3.6 分子生物學(xué)鑒定

采用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，以此基因組DNA為模板，使用ITS的通用引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），擴(kuò)增ITS序列。PCR條件：94 ℃預(yù)變性4.0 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.0 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10.0 min。測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，將測(cè)得的ITS序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行BLAST分析，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源序列，與已知序列進(jìn)行比較分析，找出與其相似性最高的菌株，確定菌株的生物學(xué)分類(lèi)地位[17-18]，利用MEGA Version 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.7 指標(biāo)測(cè)定

1.3.7.1 總酸和pH值測(cè)定

總酸測(cè)定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中電位滴定法，以檸檬酸計(jì)；pH值用pH計(jì)測(cè)定。

1.3.7.2 降酸率的計(jì)算

式中：A0為未發(fā)酵樣品中總酸或有機(jī)酸的質(zhì)量濃度；A1為發(fā)酵結(jié)束后總酸或有機(jī)酸的質(zhì)量濃度。

1.3.7.3 有機(jī)酸組分測(cè)定

HPLC條件：色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.5% KH2PO4溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 2.5），流動(dòng)相B為甲醇，A-B體積比為97∶3；等度洗脫10 min，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品系列和樣品。采用外標(biāo)法對(duì)樣液中的有機(jī)酸定量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：分別用純凈水溶解配制不同質(zhì)量濃度的L-蘋(píng)果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析，得到峰面積（x）和有機(jī)酸質(zhì)量濃度（y）的回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

樣品處理：樣品4 000 r/min離心15 min[19]，吸取上清液于容量瓶中，用超純水定容，混勻，稀釋為適合濃度。用0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 降酸菌篩選

用檸檬酸固體培養(yǎng)基對(duì)降酸菌株進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，共有8 株菌可利用檸檬酸生長(zhǎng)，分別接種到檸檬酸液體培養(yǎng)基中，比較菌株降酸能力，選擇降酸速度快且降酸量高的菌株。

圖1 各菌株的降酸效果Fig. 1 Deacidification abilities of eight isolates

由圖1可知，不同菌株的降酸效果不同，總酸降低速率均呈先增加后降低趨勢(shì)。其中來(lái)自土壤的菌株T2和來(lái)自果實(shí)的菌株G4降酸效果最好。在發(fā)酵8 d后，菌株T2總酸質(zhì)量濃度從20 g/L下降到7.25 g/L，菌株G4下降到6.55 g/L，均可降解60%以上的總酸，其他菌株的降酸效果不如這2 株菌，故選擇對(duì)降酸效果最好的菌株T2和G4進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 紅樹(shù)莓果汁降酸效果

將菌株T2和G4分別接入總酸質(zhì)量濃度（以檸檬酸計(jì)）25.16 g/L、pH 3.08的紅樹(shù)莓果汁中，28 ℃靜置發(fā)酵8 d，以未接菌紅樹(shù)莓果汁為對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間所取樣品的總酸和pH值。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中紅樹(shù)莓果汁總酸和p值變化Fig. 2 Variations in total acidity and pH of red raspberry juice during fermentation and storage

由圖2可知，對(duì)照果汁中總酸和pH值的變化很小，接入降酸菌的果汁與對(duì)照果汁相比，變化明顯。菌株T2和G4在發(fā)酵過(guò)程中總酸變化不穩(wěn)定，但總體呈下降趨勢(shì)，pH值也相應(yīng)發(fā)生了一定變化。發(fā)酵8 d后，菌株T2使果汁總酸質(zhì)量濃度下降到11.24 g/L，降解果汁中55.32%的總酸，pH值由3.08上升到3.27；菌株G4使果汁總酸質(zhì)量濃度下降到9.96 g/L，降解果汁中60.41%的總酸，pH值由3.08上升到3.36。

2.3 紅樹(shù)莓果汁降酸過(guò)程中有機(jī)酸變化

2.3.1 樣品測(cè)定結(jié)果

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品和紅樹(shù)莓果汁有機(jī)酸色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of organic acid standards and red raspberry juice

由圖3a可知，有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離效果良好。圖3b～d為樣品稀釋20 倍發(fā)酵8 d的檢測(cè)結(jié)果，3號(hào)色譜峰為檸檬酸色譜峰，發(fā)酵結(jié)束后峰面積明顯變小，可知降酸菌將紅樹(shù)莓果汁中的檸檬酸進(jìn)行了降解。

2.3.2 降酸發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸的變化

圖4 菌株T2（a）和菌株G4（b）發(fā)酵過(guò)程中紅樹(shù)莓汁有機(jī)酸含量變化Fig. 4 Variations in organic acid concentrations of red raspberry juice during fermentation with strains T2 (a) and G4 (b)

發(fā)酵所使用的紅樹(shù)莓果汁總酸質(zhì)量濃度為25.16 g/L，檸檬酸質(zhì)量濃度為22.87 g/L，占總酸的90.9%，所以檸檬酸為紅樹(shù)莓果汁中的主要有機(jī)酸，可通過(guò)降解檸檬酸進(jìn)而降低果汁總酸。由圖4可知，隨著靜置發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，接種菌株T2和G4的果汁中檸檬酸含量持續(xù)下降，L-蘋(píng)果酸含量整體均呈下降趨勢(shì)，琥珀酸含量在第1天增加后呈下降趨勢(shì)，L-蘋(píng)果酸和琥珀酸含量均在5～8 d保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，α-酮戊二酸含量在第2天降到最低，之后呈現(xiàn)相似的緩慢波動(dòng)上升趨勢(shì)。與0 d的紅樹(shù)莓果汁相比，發(fā)酵8 d，菌株T2降檸檬酸效果顯著（P＜0.05），檸檬酸質(zhì)量濃度為9.48 g/L，下降了58.55%，L-蘋(píng)果酸含量下降了44.67%，琥珀酸含量下降了9.16%；菌株G4降檸檬酸效果也顯著（P＜0.05），檸檬酸質(zhì)量濃度為9.25 g/L，下降了59.54%，L-蘋(píng)果酸含量下降了43.12%，琥珀酸含量下降了20.29%。

果汁發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)酸隨著發(fā)酵菌種生長(zhǎng)與代謝而發(fā)生改變[20]。它們作為中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物參與代謝的各種基本途徑[21]，如蘋(píng)果酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和檸檬酸，這些酸屬于三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）的鏈環(huán)酸[22]，它們的定量可以提供細(xì)胞中發(fā)生的分解代謝和合成代謝過(guò)程的基本信息[23]。

發(fā)酵過(guò)程中，L-蘋(píng)果酸含量的緩慢降低可能是菌株在降解檸檬酸的同時(shí)降解L-蘋(píng)果酸。α-酮戊二酸質(zhì)量濃度在發(fā)酵過(guò)程中波動(dòng)可能主要是由代謝積累引起的[24]。α-酮戊二酸是氨基酸和核苷酸生物合成所必需的前體代謝物，它在TCA過(guò)程中基本沒(méi)有凈生成，2～8 d含量升高可能是由于一些回補(bǔ)途徑合成得到[25]。檸檬酸通過(guò)其他途徑降解，也可提高α-酮戊二酸含量。檸檬酸可以首先在順烏頭酸酶的催化作用下生成異檸檬酸，然后通過(guò)NADP-異檸檬酸脫氫酶催化生成α-酮戊二酸[26]。琥珀酸是糖類(lèi)和大部分氨基酸代謝過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物[27]。推測(cè)琥珀酸含量在第1天增加的原因是檸檬酸經(jīng)TCA代謝，使得含量略有增加[28]。琥珀酸下降的原因可能是被降酸菌直接消耗代謝或者發(fā)生轉(zhuǎn)化生成其他物質(zhì)，經(jīng)其他途徑降解。有的酵母菌能夠同化琥珀酸，通過(guò)合成反應(yīng)利用，也會(huì)導(dǎo)致琥珀酸含量降低。

結(jié)果表明，菌株T2有機(jī)酸總體變化趨勢(shì)與菌株G4的變化趨勢(shì)相似，菌株T2和G4是2 株可分解檸檬酸且降酸能力較強(qiáng)的優(yōu)良菌株。

2.4 降酸菌形態(tài)特征

菌株T2和G4的形態(tài)特征相似，在麥芽汁固體培養(yǎng)基上的形態(tài)如圖5A所示，菌落為乳白色，菌落較大，呈圓形，具有一定厚度，中間略有凸起，表面光滑、濕潤(rùn)，質(zhì)地均勻較黏稠，容易挑起，邊緣整齊。顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)如圖5B所示，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。繁殖方式為芽殖，在酵母產(chǎn)子囊孢子培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)3 d，顯微鏡觀(guān)察，子囊內(nèi)產(chǎn)生1～4 個(gè)光滑的球形子囊孢子。在麥芽汁液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)基表面有醭形成。

圖5 菌株菌落形態(tài)（A）和細(xì)胞形態(tài)（B）（×1 000）Fig. 5 Colonial morphological characteristics (A) and cell morphology (B)of strains T2 and G4 (×1 000)

2.5 生理生化鑒定

表1 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical properties of strains T2 and G4

由表1可知，菌株T2和G4均能利用葡萄糖，不能利用乳糖、半乳糖、蔗糖等其他糖源，除均能同化葡萄糖、甘油和乙醇外，其他碳源均不能被同化，菌株T2和G4可同化硫酸銨，不能同化硝酸鹽。

2.6 分子生物學(xué)鑒定

2.6.1 菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果

將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在紫外燈照射下觀(guān)察，結(jié)果如圖6所示。菌株T2和G4的ITS序列PCR產(chǎn)物電泳樣品條帶出現(xiàn)在300～500 bp之間，大小均為400 bp左右。

圖6 菌株T2和G4的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 6 Agarose gel electrophoretograms of PCR amplified DNA fragments of strains T2 and G4

2.6.2 菌株T2和G4的ITS序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

通過(guò)對(duì)降酸菌的ITS序列進(jìn)行同源性分析，確定菌株T2和G4種屬。菌株T2和G4的ITS序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，利用NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）上的BLAST軟件與已知菌株序列進(jìn)行比對(duì)分析，并依此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。菌株T2和G4的ITS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖7所示。

圖7 菌株T2和G4的ITS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig. 7 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strains T2 and G4

從圖7可知，菌株T2和G4與P. terricola和陸生伊薩酵母（I. terricola）的同源性最好，親緣關(guān)系最近。多重序列分析已將伊薩酵母屬（Issatchenkia）歸入畢赤酵母屬（Pichia），這2 個(gè)屬菌株的親緣關(guān)系較近[29-30]，可將P. terricola和I. terricola認(rèn)定為一種菌，即I. terricola。結(jié)合上述菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定菌株T2和G4均為I. terricola，并分別重新定名為I. terricolaWJL-T2、I. terricolaWJL-G4。

3 結(jié)論與討論

利用檸檬酸培養(yǎng)基對(duì)紅樹(shù)莓果園土壤和紅樹(shù)莓鮮果中的酵母菌進(jìn)行篩選，得到具有良好降解檸檬酸效果的菌株T2和G4，在檸檬酸液體培養(yǎng)基中，菌株T2和G4的總酸降酸率分別為63.73%和67.23%。在紅樹(shù)莓果汁中，菌株T2和G4可分別降解55.32%和60.41%的總酸，58.55%和59.54%的檸檬酸。經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)及分子學(xué)鑒定，結(jié)果均為I. terricola，由于降酸速率和效果略有不同，最終將菌株T2和G4分別命名為WJL-T2和WJL-G4，后續(xù)可以通過(guò)其他測(cè)序方法進(jìn)一步確定2 株菌的關(guān)系。王立芳等[31]從葡萄園土壤中分離得到1 株可降解L-蘋(píng)果酸和檸檬酸的菌株為I. terricola，測(cè)得該菌株對(duì)12 g/L的L-蘋(píng)果酸和檸檬酸的降解率分別達(dá)到93.17%和92.08%。說(shuō)明I. terricola具有很好的降酸能力。

I. terricola屬于果酒釀造的相關(guān)酵母。Bezerra-Bussoli等[32]的研究表明，通常情況下，自然發(fā)酵葡萄酒的發(fā)酵始于優(yōu)勢(shì)非釀酒酵母，它們來(lái)自于葡萄汁和生長(zhǎng)環(huán)境，并決定了葡萄酒的品質(zhì)和風(fēng)味，非釀酒酵母中就包括I. terricola和畢赤酵母屬的酵母。Drumonde-Neves等[33]在葡萄園中鑒定出包括P. terricola在內(nèi)的23 種酵母菌種。在果酒釀造過(guò)程中，釀酒酵母會(huì)面臨果實(shí)中有機(jī)酸尤其是檸檬酸的脅迫，高質(zhì)量濃度檸檬酸（19.21～76.86 g/L）或pH≤2.80時(shí)，釀酒酵母的生長(zhǎng)受到抑制[34]，因此，將降酸菌應(yīng)用于果酒降酸，提高pH值，有助于果酒生產(chǎn)。隋韶奕[35]利用I. terricolaS8進(jìn)行生物降酸，降酸率為64.87%，并通過(guò)熱浸提等工藝釀造了全汁樹(shù)莓干型酒，總酸為6.1 g/L?？梢?jiàn)，I. terricola應(yīng)用在高酸果汁及果酒的降酸，能達(dá)到理想的效果。

從降酸發(fā)酵過(guò)程可知，在第8天檸檬酸含量仍有下降趨勢(shì)，說(shuō)明降酸率仍有可能增加；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)降酸菌在有氧條件下降酸速率更快，關(guān)于2 菌株的最適降酸條件，可綜合降酸率和對(duì)果汁中活性物質(zhì)影響等因素，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)摸索。降酸菌的降酸途徑較復(fù)雜，可能不只TCA代謝一條途徑，后續(xù)研究還可以測(cè)定檸檬酸代謝中的相關(guān)酶類(lèi)活性，更準(zhǔn)確深入地研究降酸的途徑和機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為降低紅樹(shù)莓果汁酸度、提高果汁品質(zhì)、研究生物降酸提供一定參考。