賈 娜，林世文，王樂田，劉登勇

（渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧 錦州 121013）

肌原纖維蛋白是肌肉蛋白的主要成分，其主要特性之一是在加熱過程中可形成三維立體的凝膠網(wǎng)狀結構。熱誘導凝膠網(wǎng)絡的形成是影響乳化型肉制品質量的關鍵，良好的凝膠結構能夠提高產(chǎn)品的保水保油性，使產(chǎn)品質地均勻、理化性質穩(wěn)定。然而在加工和貯藏過程中，蛋白質容易受到活性氧的攻擊而發(fā)生氧化，導致其結構發(fā)生改變，功能特性降低，從而使肉的嫩度、風味、口感、保水保油性降低，產(chǎn)品質地變差，貨架期縮短[1-2]。

肉類制品中添加抗氧化劑是防止蛋白質氧化的有效手段之一。相較于人工化學合成抗氧化劑，天然抗氧化劑因更加安全和健康而備受關注[3]。植物提取物是天然抗氧化劑的良好來源，多酚為其中發(fā)揮抗氧化作用的主要組分[4]。迷迭香、黑加侖以及白葡萄提取物等都被證實具有良好的抑制肉品氧化的作用[5-7]。然而，多酚在肉品中發(fā)揮抗氧化作用的同時，還能以共價和非共價的方式與蛋白質發(fā)生相互作用而改變蛋白質的空間結構、功能基團和聚合形式，從而影響蛋白質的功能特性以及產(chǎn)品的感官性狀和營養(yǎng)價值[8]。如高添加量的綠原酸、迷迭香酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）以及綠茶提取物均能夠與肌原纖維蛋白發(fā)生相互作用，改變蛋白的氨基酸側鏈基團、二級結構、三級結構，與蛋白發(fā)生交聯(lián)，最終導致其不能形成良好的凝膠網(wǎng)絡結構，削弱其凝膠特性[9-12]。二硫鍵和疏水相互作用是凝膠形成過程中的2 個主要作用力[13-14]，因此，研究多酚對肌原纖維蛋白巰基和表面疏水性的影響，闡明二者變化與凝膠特性之間的內(nèi)在聯(lián)系，可為拓展多酚在肉制品中的應用提供理論依據(jù)。

沒食子酸學名為3,4,5-三羥基苯甲酸，有良好的抗氧化性[15]。因此，本研究選擇沒食子酸為抗氧化劑，添加不同量的沒食子酸到肌原纖維蛋白中，測定蛋白質巰基含量、表面疏水性、凝膠強度、凝膠保水性和流變特性，并對凝膠的微觀結構進行觀察，研究沒食子酸誘導肌原纖維蛋白巰基和表面疏水性變化對蛋白凝膠特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長肌購于當?shù)爻校粵]食子酸 美國Sigma公司；氯化鈉、磷酸鹽、三氯乙酸、氯化鎂、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯仿、甲醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Allegra 64R冷凍離心機 美國Beckman公司；FE20 pH計、PL203型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T25數(shù)顯型均質機 德國IKA集團；UV2550紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；DKS24電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；Discovery DHR-1流變儀 美國TA公司；S4800場發(fā)式掃描電鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取及沒食子酸-肌原纖維蛋白混合體系的制備

提取的肌原纖維蛋白溶于含有0.6 mol/L NaCl的磷酸緩沖溶液（pH 6.0、10 mmol/L），向其中添加不同量的沒食子酸制備沒食子酸-肌原纖維蛋白反應體系，蛋白最終質量濃度為40 mg/mL，沒食子酸最終添加量為10、50、100 μmol/g和200 μmol/g蛋白，對照組為未添加沒食子酸的肌原纖維蛋白。

1.3.2 蛋白質巰基含量的測定

參照Ellman[17]的方法進行測定，將1.3.1節(jié)制備的肌原纖維蛋白溶液稀釋至質量濃度為10 mg/mL，用于測定巰基含量。取蛋白溶液1 mL與8 mL的Tris-甘氨酸混合，均質后離心15 min（4 ℃、10 000 r/min），取上清液4.5 mL與0.5 mL濃度為10 mmol/L的Ellman試劑反應，反應30 min后（旋渦混合，靜置30 min）用紫外分光光度計在412 nm波長處測量吸光度。用13 600 L/（mol·cm）的摩爾吸光系數(shù)表示巰基含量。

1.3.3 表面疏水性的測定

參照Chelh等[18]的方法，將1.3.1節(jié)制備的肌原纖維蛋白溶液稀釋至質量濃度為5 mg/mL、用于測定表面疏水性。取1 mL的蛋白溶液與200 μL質量濃度為1 mg/mL的溴酚藍（溶于去離子水）于室溫下攪拌10 min，然后離心15 min（4 ℃、6 000 r/min），取上清液稀釋10 倍后用紫外分光光度計在595 nm波長處測量吸光度。表面疏水性用下式表示：

1.3.4 溶解度的測定

由于研究范圍較大，輻射距離較長，整段天際線所包含的構成要素數(shù)量及形式過多。因此以道路分隔及既有街區(qū)為基礎，將整段天際線較為均勻地劃分為7段樣本，每段長度約500～700m。一方面控制樣本尺度以便于受訪人在之后的調查問卷中進行評價判斷，另一方面增加樣本數(shù)量為后續(xù)天際線評價定量化、規(guī)律化的探討提供了基礎。

將1.3.1節(jié)制備的肌原纖維蛋白溶液用磷酸緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7）稀釋至10 mg/mL，量取5 mL于15 mL離心管中，在4 ℃的冰箱放置2 h，在10 000 r/min冷凍離心20 min。量取1 mL上清液，用雙縮脲法測定蛋白質濃度，按下式計算溶解度：

1.3.5 蛋白凝膠制備

稱取蛋白質（40 mg/mL）樣品15 mL，裝于密封的玻璃瓶中（25 mm×40 mm），在72 ℃水浴加熱10 min，形成凝膠后取出，在冰浴中冷卻1 h。在4 ℃的冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 凝膠強度和保水性的測定

用TA-XT plus型質構分析儀測定肌原纖維蛋白凝膠的凝膠強度。采用Salvador等[19]的方法測定凝膠保水性，稱取離心管的質量，記為m0。取一定質量凝膠（5～8 g）放入離心管底部，此時離心管的質量，記為m1。4 ℃、3 000 r/min離心10 min后，用中性濾紙吸干離心管中凝膠析出的水分，稱取此時離心管質量，記為m2。計算公式如下：

1.3.7 流變特性的測定

將按方法1.3.1節(jié)制備的肌原纖維蛋白溶液（40 mg/mL）均勻涂抹在測試平臺上。測試參數(shù)設置為：頻率0.1 Hz，應變力為2%，上下板的夾縫為1 mm，升溫程序為20～80 ℃，升溫速率為1 ℃/min。測試平板外蛋白與空氣接觸處，用蓋板密封。

1.3.8 肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的測定

參照李明清[20]的方法并適當修改。將凝膠樣品緊密粘貼在掃描電鏡樣品臺上，用E-1010型離子濺射鍍膜儀將樣品表面噴金，放入掃描電鏡的樣品盒中待檢，加速電壓5 kV，放大10 000 倍，進行掃描結果觀察。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 沒食子酸對肌原纖維蛋白巰基含量的影響

肌原纖維蛋白中巰基基團數(shù)量較多，其中肌球蛋白含有42 個巰基[21]，易受到活性氧的攻擊轉化為二硫鍵。因此，巰基對于穩(wěn)定蛋白質的空間結構有著重要的作用。如圖1所示，沒食子酸顯著降低了肌原纖維蛋白巰基含量（P＜0.05），但隨著沒食子酸添加量的增加，巰基含量變化不顯著（P＞0.05）。有研究表明，酚類物質易被氧化形成醌，然后可與巰基通過Michael加成生成巰基-醌加成產(chǎn)物，因此，巰基含量減少可能是由于沒食子酸與巰基發(fā)生了共價交聯(lián)[22]。綠原酸、迷迭香酸、EGCG均被證實可促進肌原纖維蛋白巰基含量的降低，其原因也是由于生成了巰基-醌加成產(chǎn)物[9-11]，這與本研究的結果一致。此外，巰基之間形成二硫鍵是導致巰基含量降低另一主要原因。疏水基團的暴露可促進蛋白質發(fā)生疏水性聚集，從而導致蛋白結構更加緊密，巰基之間更容易發(fā)生交聯(lián)形成二硫鍵[23]。有研究證實，鱈魚肌動球蛋白表面疏水性增加會導致疏水基團暴露，從而促進蛋白變性聚集，進一步導致巰基交聯(lián)[24]。

圖1 沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig. 1 Effect of added gallic acid on the sulfhydryl group content of myofibrillar protein

2.2 沒食子酸對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性可反映疏水性氨基酸在蛋白質表面的分布情況，與蛋白質的功能特性密切相關，一般用蛋白質中疏水性氨基酸與溴酚藍的結合量表示表面疏水性的大小。沒食子酸對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響如圖2所示，隨著沒食子酸添加量的增大，表面疏水性顯著增加（P＜0.05），當沒食子酸添加量為200 μmol/g時，表面疏水性達到最大值。表面疏水性增加是因為沒食子酸與肌原纖維蛋白相互作用，改變蛋白構象，使蛋白結構展開，包埋在內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露在表面[25]。疏水相互作用是肌原纖維蛋白熱誘導凝膠形成過程中的主要作用力之一[26]，因此表面疏水性適當增加，可使更多的疏水基團參與到熱誘導凝膠形成的過程中，從而有利于凝膠特性；但表面疏水性增加程度較大，會導致蛋白質穩(wěn)定性降低，蛋白質與水的相互作用減弱，容易發(fā)生疏水性聚集，蛋白質發(fā)生變性，不利于凝膠網(wǎng)絡結構的形成。Cao Yungang等[9]研究表明，綠原酸在低添加量時對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響不大，而在150 μmol/g時，表面疏水性顯著增加，可見高添加量的綠原酸促進了蛋白結構展開，與本研究結果相類似。而迷迭香酸、EGCG降低了肌原纖維蛋白的表面疏水性[10-11]，與本研究結果相反，這主要是由于酚的種類和添加量不同所致。

圖2 沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of added gallic acid on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.3 沒食子酸對肌原纖維蛋白溶解度的影響

圖3 沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig. 3 Effect of added gallic acid on the solubility of myofibrillar protein

由圖3可知，沒食子酸添加量為10 μmol/g時，肌原纖維蛋白的溶解度與對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05），隨著沒食子酸添加量的增加，蛋白的溶解度也顯著增大（P＜0.05）。由此可知，沒食子酸對蛋白質的溶解度具有一定的促進作用。通常，蛋白質溶解度增加有利于提高蛋白質的功能特性，但從本研究結果來看，50、100、200 μmol/g沒食子酸使凝膠強度和保水性顯著降低（P＜0.05）。因此，可能是由于沒食子酸導致巰基-醌共價交聯(lián)產(chǎn)物的形成以及肌原纖維蛋白發(fā)生疏水性聚集，蛋白質結構被破壞，促使小分子蛋白質片段溶出，從而導致溶解度增加。

2.4 沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠強度和保水性的影響

圖4 沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白凝膠強度和保水性的影響Fig. 4 Effects of added gallic acid on the gel strength and waterholding capacity of myofibrillar protein gels

如圖4所示，當沒食子酸添加量為10 μmol/g時，凝膠強度較對照組有所增長，但差異不顯著（P＞0.05）。隨著沒食子酸添加量的增大，凝膠強度顯著降低（P＜0.05），添加量為200 μmol/g時，比對照組和添加10 μmol/g時的凝膠強度降低了73.2%和73.8%（P＜0.05）。凝膠保水性的變化趨勢與凝膠強度相似，即沒食子酸添加量為10 μmol/g時，保水性無顯著變化（P＞0.05），當沒食子酸添加量增加時，保水性顯著降低（P＜0.05）。以上結果說明低添加量的沒食子酸（10 μmol/g）對蛋白凝膠特性影響不大，而中、高添加量的沒食子酸（50、100、200 μmol/g）對凝膠形成有破壞作用，甚至導致不能形成完整的凝膠結構。

如前所述，10 μmol/g沒食子酸使表面疏水性適度提高，因而可以增加凝膠過程中的疏水相互作用，而表面疏水性過度增加則會導致蛋白質變性聚集，不能充分溶脹，從而不利于凝膠的形成。此外，在熱誘導凝膠形成過程中，肌原纖維蛋白巰基轉化成二硫鍵也是維持凝膠的主要作用力之一。一般認為，酚氧化成醌以后與巰基的共價交聯(lián)具有兩方面的作用，一是二者過度交聯(lián)能夠減少凝膠形成過程中二硫鍵的生成，因而不利于凝膠形成[7]；另外，也有觀點認為低添加量的酚有利于凝膠形成，因為酚與巰基發(fā)生非二硫鍵共價交聯(lián)，酚在蛋白之間起到連接的作用，增加了蛋白質的聚合，因此有利于凝膠特性[9-10]。從本研究結果來看，10、50、100、200 μmol/g沒食子酸使巰基含量降低的效果相同，因此，一方面沒食子酸有可能起到連接蛋白的作用，但是添加量為50、100、200 μmol/g時，凝膠強度和保水性降低，這可能是由于疏水相互作用導致的蛋白變性起主導作用，掩蓋了沒食子酸對蛋白的連接作用；另一方面，沒食子酸也有可能通過阻礙二硫鍵交聯(lián)而削弱肌原纖維蛋白形成凝膠的能力，但添加量為10 μmol/g時，凝膠強度和保水性無顯著變化，則可能也是由于適度增加的疏水相互作用起主導作用，增強了凝膠特性。因此，與巰基-醌共價交聯(lián)產(chǎn)物的形成相比，沒食子酸導致的疏水性增加可能是造成蛋白凝膠特性改變的主要因素。結合蛋白凝膠的微觀結構來看，隨著沒食子酸添加量的增加，蛋白凝膠表面變得粗糙，孔隙變大，蛋白之間的相互連接減少，從而降低了蛋白凝膠的強度和保水性。Tang Changbo等[27]研究表明低濃度的迷迭香酸對肌原纖維蛋白凝膠強度影響不大，而高濃度的迷迭香酸則會形成巰基-醌和氨基-醌加合物，阻斷肌原纖維蛋白的二硫鍵交聯(lián)，降低蛋白的持水能力及凝膠強度，這與本實驗沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響結果相似。此外，綠原酸和EGCG也被證實在高添加量時能夠降低肌原纖維蛋白的凝膠強度和保水性[9,11]。

2.5 沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠流變特性的影響

流變特性是評價肌原纖維蛋白凝膠黏彈性的常用指標，儲能模量（G’）又稱彈性模量，用來反映凝膠形成過程中的彈性，損耗模量（G”）又稱黏性模量，可反映凝膠形成過程中的黏度。由圖5所示，對照組的G’在45 ℃和50 ℃時有2 個明顯的轉變峰，峰值在45 ℃時，為凝膠開始形成階段，是由肌球蛋白頭部的亞基變性導致的，峰值在50 ℃時，是由于肌球蛋白尾部的聚集、變性，分子熱運動加劇，流動性增強，G’降低，隨后隨著溫度的升高，肌原纖維蛋白最終形成不可逆的凝膠網(wǎng)絡結構[28]。當沒食子酸添加量為10 μmol/g時，在50 ℃以前G′的趨勢與對照組相同，在50 ℃之后G’高于對照組，說明最終形成的凝膠彈性較大，可能的原因為沒食子酸促進大部分肌球蛋白分子展開，增強了蛋白與蛋白以及蛋白與沒食子酸之間的交聯(lián)作用，從而產(chǎn)生了不可逆的熱誘導凝膠結構。當沒食子酸添加量為50、100、200 μmol/g時，45 ℃和50 ℃的峰幾乎消失，50 ℃之前的曲線變得平緩，說明沒有形成凝膠網(wǎng)絡結構，主要是由于高添加量的沒食子酸可能通過生成巰基-醌加成物以及促進疏水基團嚴重暴露而導致肌原纖維蛋白發(fā)生變性、聚集，阻礙了肌原纖維蛋白熱誘導形成三維網(wǎng)狀凝膠結構，從而降低了G’[29]。溫度超過50 ℃，沒食子酸添加量為50 μmol/g時，最終仍能形成弱的凝膠結構，但添加量為100～200 μmol/g時，完全不能形成凝膠結構。由此可見，流變特性的變化結果與前面凝膠特性的變化相一致。G”的變化趨勢與G’相似，即沒食子酸添加量為10 μmol/g時，曲線形狀與對照組相似，仍能形成較好的凝膠網(wǎng)絡結構，而添加量為50、100、200 μmol/g時，峰值消失，曲線趨于平緩，幾乎不能形成凝膠網(wǎng)絡結構。與本研究結果相似，高濃度的綠原酸、EGCG、迷迭香酸也導致肌原纖維蛋白凝膠形成過程中G’降低[9-11]。

圖5 沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠流變特性的影響Fig. 5 Effect of added gallic acid on the rheological properties of myofibrillar protein gels

2.6 沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的影響

圖6 沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的影響Fig. 6 Effect of added gallic acid on the microstructure of myofibrillar protein gels

蛋白凝膠的微觀結構是凝膠狀態(tài)的直觀反映。對照組（圖6a）的肌原纖維蛋白凝膠結構均勻、較致密、孔隙小形狀規(guī)則。沒食子酸添加量為10 μmol/g（圖6b）時，肌原纖維蛋白凝膠的微觀結構變得更加致密、光滑和均勻，有較好的成膠能力。沒食子酸添加量增大到50、100、200 μmol/g時（圖6c～e），凝膠網(wǎng)絡結構發(fā)生明顯變化，逐漸變得粗糙松散、不均勻，孔隙越來越大，凝膠斷裂，伴有片層狀結構出現(xiàn)，可能的原因為中、高添加量的沒食子酸與肌原纖維蛋白發(fā)生相互作用，阻礙了蛋白分子之間的交聯(lián)，從而使蛋白膠束分布不均勻，蛋白網(wǎng)絡結構較差[30]。此外，還有可能是疏水基團過度暴露，導致蛋白質發(fā)生疏水性聚集、變性，最終不能形成良好的凝膠網(wǎng)絡結構。通過微觀結構發(fā)現(xiàn)添加高添加量的沒食子酸導致凝膠三維網(wǎng)狀結構較差，凝膠的彈性降低，蛋白的成膠能力越來越弱，甚至完全不能形成凝膠，這也與凝膠強度、保水性以及流變特性的結果一致。

3 結 論

隨著沒食子酸添加量的增加，肌原纖維蛋白的巰基含量降低，表面疏水性增加。沒食子酸添加量較低（10 μmol/g）時，與對照相比，凝膠強度與保水性均無顯著變化，流變特性無明顯變化；沒食子酸添加量較高（50、100、200 μmol/g）時，凝膠強度與保水性顯著降低，流變曲線轉變峰消失，趨于平緩。微觀結構結果進一步證實了高添加量沒食子酸對凝膠特性的不利影響，凝膠出現(xiàn)片層狀結構及孔洞。總體來說，低添加量沒食子酸對蛋白的凝膠特性無負面影響，而高添加量則不利于凝膠化，可能是由于高添加量的沒食子酸誘導肌原纖維蛋白巰基和表面疏水性發(fā)生變化，從而對凝膠特性產(chǎn)生不利影響，并且表面疏水性的變化可能對凝膠特性的改變起主導作用。