朱藝丹

摘 要：骨組織是由有機(jī)和無(wú)機(jī)成分組成的復(fù)合材料。在外科手術(shù)中常常需要涉及到骨骼的固定和修復(fù)，傳統(tǒng)的植入鋼釘固定連接方法不僅與組織不相容，增加感染風(fēng)險(xiǎn)而且需要二次去除，給患者增加額外痛苦，而采用生物友好型的骨粘合劑則有效的避免了上述弊端，且骨粘合劑在對(duì)骨組織進(jìn)行粘接后，隨著骨組織的愈合，降解為無(wú)毒產(chǎn)物。文章旨在概述骨粘合劑的發(fā)展、現(xiàn)狀和當(dāng)今的知識(shí)的基礎(chǔ)上。指出明膠基復(fù)合材料具有良好的生物相容性，可降解性，能夠很好的運(yùn)用于骨組織修復(fù)和骨粘合劑中。在基礎(chǔ)研究人員和外科醫(yī)生的共同努力下，這一課題取得了巨大的進(jìn)展。結(jié)果表明，人工合成生物材料的應(yīng)用將在未來(lái)的骨科手術(shù)中取得成功。

關(guān)鍵詞：骨粘合劑; 明膠; 降解性; 生物相容性

中圖分類號(hào)：TQ431.3;R318.08 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-5922（2020）10-0005-05

Abstract：Bone tissue is a composite material composed of organic and inorganic components. In surgical operations， the fixation and repair of bone are often involved. The traditional fixation and connection method of implanted steel nail is not only incompatible with the tissue， increasing the risk of infection， but also needs to be removed twice， which causes extra pain to the patients. However， the use of bio-friendly bone adhesive can effectively avoid the above disadvantages， and after the bone adhesive is bonded to the bone tissue， it degrades into a non-toxic product as the bone tissue heals. The following paper aims to summarize the development， current situation and current knowledge of bone adhesives. It is pointed out that gelatin-based composite materials have good biocompatibility and degradability， and can be used in bone tissue repair and bone adhesive. With the joint efforts of basic researchers and surgeons， great progress has been made in this subject. The results show that the application of synthetic biomaterials will be successful in the orthopedic surgery.

Key words：bone adhesive; gelatin; degradability; biocompatibility

0? ? ?引言

開發(fā)骨粘合系統(tǒng)的第一次嘗試來(lái)自埃及，已有4000多年的歷史。幾個(gè)世紀(jì)后的1772年，巴黎石膏被引進(jìn)，至今仍被用于骨折固定。其他的如環(huán)氧樹脂，氰基丙烯酸酯，聚氨酯和纖維粘合劑。但這些探索多以失敗告終，因?yàn)樗鼈儾环厢t(yī)學(xué)要求，如生物相容性、儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性、對(duì)人體無(wú)毒性、可消毒、易于使用、可吸收和降解、能在潮濕環(huán)境中固化。

盡管這一領(lǐng)域的研究由來(lái)已久，目前尚未找到一種有效運(yùn)用于臨床上適用的替代方法。而明膠基復(fù)合材料，能夠快速地粘合組織，即使在有水分的情況下，作為一種外科粘合劑和止血?jiǎng)┤〉昧肆己玫膽?yīng)用效果，具有良好的生物相容性，粘接能力以及可降解能力，被認(rèn)為是最有可能運(yùn)用于骨粘合劑的實(shí)際應(yīng)用中。文章概述了骨粘合劑的要求、發(fā)展歷史、現(xiàn)狀和研究成果總結(jié)，指出明膠基復(fù)合材料具有良好的生物相容性，可降解性，能夠很好的運(yùn)用于骨組織修復(fù)和骨粘合劑中。

1? ? ?醫(yī)用骨粘合劑發(fā)展歷史

一個(gè)多世紀(jì)前，柏林的Gluck提出了利用生物材料進(jìn)行骨結(jié)合的想法，當(dāng)時(shí)他將軟組織與雞血衍生物結(jié)合，將骨組織與“l(fā)itocolle”結(jié)合。他報(bào)告了用樹脂、浮石和巴黎石膏制成的骨膠。第一種骨粘合劑是在1931年由Hedri描述的。他把膠原蛋白和纖維蛋白的混合物稱為“骨細(xì)胞”。這種“骨細(xì)胞”促進(jìn)骨折愈合并展現(xiàn)了良好的初始結(jié)合強(qiáng)度，但嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)阻止了其使用。

1.1? ?環(huán)氧樹脂

在1958年報(bào)告了一例用環(huán)氧樹脂在人體內(nèi)固定植入物的病例，據(jù)了解，這種植入物已經(jīng)放置了10多年。然而，由于這些材料，特別是硬化劑的毒理學(xué)性質(zhì)可疑，已發(fā)表的研究很少。在另一個(gè)用環(huán)氧樹脂材料粘合植入物的實(shí)例中，這種材料能夠承受一定的外力，從而在不銹鋼假體中產(chǎn)生彎曲，而不會(huì)導(dǎo)致粘接斷裂。在矯正假體的手術(shù)中，髓質(zhì)沒(méi)有反應(yīng)。在隨后的死后檢查中，假體附近的組織含有雙折射材料、纖維組織、一些滑膜襯里和許多巨細(xì)胞。在這種情況下，使用了帶有聚酰胺硬化劑的傳統(tǒng)樹脂，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為這克服了對(duì)這些材料可能毒性的反對(duì)意見。進(jìn)一步研究表明，環(huán)氧樹脂材料存在難以吸收以及不利于愈合的缺陷。環(huán)氧樹脂會(huì)在粘合劑周圍引發(fā)纖維囊，起到阻礙骨痂形成的作用，不會(huì)因水分、脂質(zhì)或血液而粘附在骨骼上，并因聚合熱而導(dǎo)致組織壞死。

1.2? ?聚氨酯泡沫

1959年，一種叫做“Ostamer”的聚氨酯泡沫被開發(fā)出來(lái)。最初，它被認(rèn)為是可生物降解的，并且具有適當(dāng)?shù)目讖揭栽试S骨生長(zhǎng)，提供良好的初始粘附性，并且被組織很好地耐受。在相關(guān)的研究報(bào)道中，詳細(xì)介紹了6例3年～ 4個(gè)月的成功病例，其中采用硬質(zhì)聚氨酯泡沫塑料填隙，夾板固定骨折骨。該材料是由異氰酸酯和多元醇組分混合加熱而成。不幸的是，其他在動(dòng)物和人類病例中使用這種材料的經(jīng)驗(yàn)非常不令人滿意。聚合溫度高達(dá)70℃，附著力弱，吸收慢。許多研究觀察到假關(guān)節(jié)炎、感染、組織壞死和瘢痕形成延遲。雖然在某些情況下獲得了成功的結(jié)果，但高百分比的失敗表明，材料本身可能存在變異性，隨之產(chǎn)生的毒性以及操作的臨界性。這導(dǎo)致了強(qiáng)烈的反作用。

1.3? ?氰基丙烯酸酯

氰基丙烯酸酯膠粘劑是由開發(fā)于1959年。它們巨大的結(jié)合強(qiáng)度和在潮濕環(huán)境中的結(jié)合能力立即引起了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。通過(guò)改變所附烷基鏈的長(zhǎng)度，可以合成各種有用的2-氰基丙烯酸酯。一般來(lái)說(shuō)，在空氣中用較短的烷基鏈氰基丙烯酸酯進(jìn)行聚合更快，但由于表面的良好潤(rùn)濕性，聚合速率和組織中的結(jié)合強(qiáng)度隨著烷基鏈長(zhǎng)度的增加而增加。

1.4? ?聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）

自20世紀(jì)30年代以來(lái)，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）已廣泛應(yīng)用于牙科和骨科手術(shù)中，用于修復(fù)體的密封。這不是真正的粘連，但與松質(zhì)骨緊密相連。研究表明，只要骨折表面沒(méi)有被完全封閉，人類骨折就可以在PMMA周圍愈合。這促使PMMA在各種骨折情況下的應(yīng)用，其中PMMA被用作常規(guī)固定的空間填充物或加固物。PMMA也被認(rèn)為是一種主要的內(nèi)固定方法。使用液體丙烯酸樹脂、磷酸蝕刻或三丁基硼烷也提高了PMMA與骨的粘合質(zhì)量。大多數(shù)研究顯示這種材料可以使骨折具有良好的固定強(qiáng)度和充分的愈合。雖然在下頜骨骨折、脊柱骨折和孤立性長(zhǎng)骨骨折中有良好的結(jié)果，但晚期移位和不愈合阻止了它們推薦作為骨粘合劑的使用。

1.5? ?纖維蛋白粘合劑

纖維蛋白粘合劑的使用始于1940年。目前它們是最流行的軟組織粘合劑。大多數(shù)纖維蛋白粘合劑系統(tǒng)由含有纖維蛋白原、凝血酶、鈣和因子XIII的混合物組成。因子XIII被認(rèn)為是體內(nèi)成功粘附的必要穩(wěn)定劑。同源纖維蛋白原治療效果較好。

博世公司對(duì)纖維蛋白凝塊作為粘合劑的體外特性進(jìn)行了廣泛的研究。其研究的纖維蛋白粘合劑（通?？s寫為FKS，來(lái)自德國(guó)的“纖維蛋白klebesystem”）在歐洲已被廣泛用于普通外科、眼科、耳鼻咽喉、泌尿外科和神經(jīng)外科等等。除了用作粘合劑外，纖維蛋白粘合劑還被證明有助于止血和加速愈合，可通過(guò)增加骨移植、皮質(zhì)骨愈合、肌腱修復(fù)和截骨術(shù)中的血運(yùn)重建率。一些研究表明纖維蛋白粘合劑在組織中具有良好的耐受性。

1.6? ?明膠間苯二酚醛

這種材料的基礎(chǔ)是明膠的性質(zhì)與結(jié)締組織相似，并且本身具有粘性。明膠與甲醛和間苯二酚交聯(lián)以提高耐水性和強(qiáng)度，制備出一種粘合劑，該粘合劑通過(guò)與甲醛交聯(lián)而與濕組織結(jié)合。動(dòng)物研究結(jié)果表明，GRF組分既可用作組織粘合劑，也可用作止血?jiǎng)＝M織刺激性低于氰基丙烯酸酯，盡管這仍然帶來(lái)一些問(wèn)題，特別是在血管閉合方面。這種材料在體外的結(jié)合強(qiáng)度優(yōu)于甲基氰基丙烯酸酯。具有優(yōu)異的拉伸強(qiáng)度和組織相容性。但是，使用這種材料在家兔的脾-肝接合手術(shù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)縫合方法中脾-肝之間很快建立了血管連接相比，在使用這種材料作為粘合劑時(shí)，家兔沒(méi)有獲得脾-肝血管連接，這容易導(dǎo)致器官因缺血而壞死。說(shuō)明這種粘合劑在實(shí)際應(yīng)用上仍存在一定的問(wèn)題。

1.7? ?低聚聚內(nèi)酯膠粘劑

脂肪族羥基羧酸衍生的生物可降解聚酯已被開發(fā)用于外科縫線、藥物遞送裝置、組織支架和骨內(nèi)固定植入物等醫(yī)療應(yīng)用。這些材料大多是由高分子量線性聚酯，如聚乳酸、聚乙醇及其共聚物制成。低聚物酯的研究較少，因?yàn)檫@些低聚物通常不具備縫合或植入所需的機(jī)械和熱性能。

2? ? ?試驗(yàn)方法

在葡聚糖主鏈上化學(xué)修飾引入2-異氰酸酯-甲基丙烯酸乙酯（IEMA）光交聯(lián)乙烯基，高碘酸鈉與鄰二醇和明膠氧化反應(yīng)引入醛基，不僅可以形成分子間網(wǎng)絡(luò)，還可以形成分子間網(wǎng)絡(luò)通過(guò)醛基增加組織交聯(lián)。同時(shí)測(cè)定體系的物理性能（粘接強(qiáng)度、溶脹率）。觀察水凝膠對(duì)細(xì)胞的粘附和增殖作用。表明該材料能夠有效應(yīng)用于骨粘合劑中。

2.1? ?材料

右旋糖酐（Mw 20 kDa）購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)上海）。2-異氰酸酯甲基丙烯酸乙酯（IEMA）購(gòu)自中國(guó)上海金瑞化學(xué)試劑有限公司。以二月桂酸二丁酯（DBTL）為催化劑，從阿拉丁試劑公司（中國(guó)上海）采購(gòu)，光引發(fā)劑2-羥基-1-[4-（羥基乙氧基）苯基-2-甲基-1-丙酮，二甲基亞砜等試劑均來(lái)自北京化學(xué)試劑有限公司（中國(guó)北京）。

2.2? ?光交聯(lián)明膠復(fù)合材料的制備

采用前驅(qū)體溶液光交聯(lián)法制備水凝膠。分別以5%的明膠和一系列濃度為15%、25%、35%、45%的Dex-U-AD濃度在PBS中制備遞推溶液，制備出Dex-U-AD/明膠水凝膠。具體步驟如下：在40℃水浴下將溶液劇烈攪拌10min，然后添加1%的光引發(fā)劑Irgacure 2959（I-2959）。光引發(fā)劑的最終濃度保持在1wt%。均勻化后，將溶液注入模具。該系統(tǒng)在紫外光源（320～480nm）下照射，導(dǎo)光板與樣品之間的距離固定在44mm，光強(qiáng)調(diào)整為5、10、15、30和50mW/cm～2。

2.3 粘合強(qiáng)度的測(cè)量

將20%明膠溶液均勻地涂在玻璃片表面，模擬活體組織。一塊玻璃的尺寸為5mm×20mm×50mm。在70℃干燥20min后，玻璃表面有一層均勻的明膠。然后，將玻璃片疊放在10mm內(nèi)，將Dex-U-AD溶液分散在其中，粘合面積為20mm×10mm。用30mw/cm～2的紫外光照射10min，使DexU在明膠片之間交聯(lián)。采用美國(guó)Instron公司的1185型萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，在室溫下以5mm/min的十字頭速度對(duì)紫外光固化后的玻璃樣品進(jìn)行測(cè)試。每個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)量5個(gè)樣品。

2.4? ?溶脹動(dòng)力學(xué)的測(cè)定

干凝膠（重量W0）在37℃下浸入PBS中，并在一定時(shí)間間隔內(nèi)持續(xù)振蕩。去除多余的表層水后，測(cè)量膨脹水凝膠（Ws）的重量，直到不再檢測(cè)到重量變化為止。

2.5? ?細(xì)胞毒性分析

采用ISO10993-5標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞（L929），加入10%胎牛血清、1.0%青霉素鏈霉素和1.2%谷氨酰胺。培養(yǎng)物主要保存在37℃、含5%二氧化碳的潮濕大氣中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，用含1×103m乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶進(jìn)行胰蛋白酶化。

用MTT法（3 - [ 4-二甲基噻唑-2-基] - 2，5 -二苯基四唑溴;噻唑藍(lán)）測(cè)定細(xì)胞活性。MTT法：用高壓蒸汽對(duì)厚度為0.2 mm（不含醋酸）的薄膜進(jìn)行消毒15min，置于24孔培養(yǎng)板上。然后將樣品在37℃的1mL DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。提取率為100 mg/mL。在此期間結(jié)束時(shí)，去除薄膜，獲得所謂的提取物。L929細(xì)胞接種于96孔板上，每孔103個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)基，用已制備好的提取液代替，再培養(yǎng)24h，然后向每個(gè)孔中加入100μLMTT溶液。在37℃孵育4h后，加入200μL二甲基亞砜以溶解福爾馬贊晶體。用振動(dòng)篩均勻旋轉(zhuǎn)溶解溶液約10min。用ELISA閱讀器（芬蘭Labsystem公司的Multiscan MK3）在570nm處檢測(cè)福爾馬贊溶液的光密度。

3 結(jié)果和討論

3.1 粘結(jié)強(qiáng)度分析

圖1（a）表明，隨著DO的增加，凝膠的粘合強(qiáng)度顯著提高。醛基不僅增加了Dex- U-AD與明膠的交聯(lián)密度，而且提高了膠粘劑的粘接力，隨著醛含量的增加，凝膠的粘結(jié)強(qiáng)度最終達(dá)到飽和。用30 wt%（25%Dex-U-AD+5%明膠）Dex-U-AD/明膠的溶解氧（DO）為41.6%表征了這種飽和狀態(tài)，得到的最高斷裂強(qiáng)度為4.16mpa，是Dex-U體系相同含量時(shí)的2倍。圖1（b）～（d）表明5%的明膠有助于提高粘合強(qiáng)度。特別是當(dāng)凝膠的固含量達(dá)到30%（25%Dex-U-AD）時(shí)，Dex-U-4（DO：22.82%）/明膠（4.16±0.72mpa）和Dex-U-8-AD（DO：10.95%）/明膠凝膠（3.46±0.032mpa）比Tisseel（0.05mpa）高83倍。

3.2? ?溶脹動(dòng)力學(xué)

未添加明膠的Dex-U-AD水凝膠由于膨脹率高和機(jī)械強(qiáng)度差而破碎成不同大小的碎片。它不能以不規(guī)則的形狀精確稱重。圖2顯示了Dex-U-AD/明膠水凝膠在pH7.4的PBS中的溶脹動(dòng)力學(xué)。隨著醛含量的增加，Dex-U-AD/明膠水凝膠的最大溶脹率降低。當(dāng)固定總固形物含量為25 wt%的Dex-U-4-AD（DO：22.82%）和5 wt%的明膠時(shí)，在100 min時(shí)，Dex-U-4-AD（DO：22.82%）凝膠的固形物含量從227±11%顯著降低到103±0.77%。

溶脹率對(duì)交聯(lián)密度、凝膠組成和電荷密度有較大影響。溶脹率的下降歸因于與其他互穿明膠的席夫反應(yīng)。因此，醛基含量越高，交聯(lián)密度越高，說(shuō)明平衡溶脹率越低。

3.3? ?細(xì)胞毒性分析

毒性試驗(yàn)是生物材料的一個(gè)重要方面。理想的生物粘附劑不應(yīng)釋放毒性產(chǎn)物或產(chǎn)生對(duì)抗性作用，可通過(guò)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，是生物材料的一項(xiàng)基本性能。圖3所示為小鼠成纖維細(xì)胞（L929）的MTT法測(cè)定所得的吸光度，該細(xì)胞是用不同類型標(biāo)本的提取液培養(yǎng)的。L929細(xì)胞活性在72h內(nèi)，除Dex-U-AD/明膠（40 wt%）外，大多數(shù)水凝膠提取物與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），72h內(nèi)細(xì)胞活力與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05），但細(xì)胞活力仍達(dá)到陰性細(xì)胞的85%左右控制。這表明Dex-U-AD/明膠對(duì)L929細(xì)胞的毒性較小。

4 結(jié)語(yǔ)

盡管在過(guò)去的10年里在組織和骨粘合劑方面做了大量的工作，但是很明顯，成功的骨粘合劑的發(fā)展還處于早期階段。環(huán)氧樹脂、氰基丙烯酸酯、聚氨酯等材料的研究，由于強(qiáng)度不夠和生物相容性差，一直沒(méi)有得到證實(shí)。然而，這一概念似乎是切實(shí)可行的，開發(fā)一種具有快速有效作用、相對(duì)無(wú)毒的材料應(yīng)該是可能的。此外，這種粘合劑還可以作為藥物的培養(yǎng)基，類似于今天使用的抗生素骨水泥。

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