韋俐霞, 荀京天, 仇丹, 姚利輝, 蔣志強(qiáng), 李亞

（寧波工程學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 寧波 315211）

0 引言

明膠是一種重要的生物質(zhì)高分子材料，由膠原蛋白部分水解得到；明膠具有良好的凝膠性、成膜性、乳化性、持水性等性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[1-4]。 明膠主要來(lái)源于哺乳動(dòng)物，其中豬明膠和牛明膠占90%以上。 由于宗教信仰、瘋牛病及口蹄疫等原因，豬、牛來(lái)源明膠的生產(chǎn)與使用受到很多限制，開(kāi)發(fā)哺乳動(dòng)物以外的明膠如魚(yú)類(lèi)明膠成為研究熱點(diǎn)[5-7]。 魚(yú)明膠亞氨基酸含量較低，在性能上與哺乳動(dòng)物明膠有很大不同，其中金槍魚(yú)產(chǎn)量大，加工過(guò)程中產(chǎn)生大量廢棄下角料，含有豐富的膠原蛋白，再開(kāi)發(fā)利用價(jià)值高[2,8]。

明膠的乳化性及其在反應(yīng)過(guò)程中的穩(wěn)定性和凝膠特性使得其在含有維生素、魚(yú)油、色素和其他活性物質(zhì)的加工過(guò)程中具有一定的優(yōu)勢(shì)，如用作油溶性營(yíng)養(yǎng)劑如維生素E、維生素A 等的乳化、包埋，但課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)不同明膠的包埋效果差距較大，反應(yīng)不穩(wěn)定。 現(xiàn)有研究主要是從明膠微觀性能如氨基酸序列、分子量等方面來(lái)分析其乳化性，或改變?nèi)榛耐獠織l件來(lái)制備乳液、乳化膜等[3,9-13]。凝膠強(qiáng)度、粘度和熔融溫度是明膠的3 個(gè)最重要的商業(yè)功能和技術(shù)特性，這些性能與明膠的來(lái)源、制備方法、制備條件等有關(guān)，但關(guān)于明膠制備方法及其宏觀性能與乳化性之間的聯(lián)系相關(guān)研究較少[6,14-17]。

明膠的制備方法主要有酸法、堿法、酶法3 種，其中以酸法和堿法為主[17-20]。 為了研究不同制備方法對(duì)明膠性能的影響，本研究以金槍魚(yú)加工過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄?mèng)~皮為原料制備了魚(yú)明膠，研究了不同制備條件得到的魚(yú)明膠產(chǎn)率、凝膠強(qiáng)度、粘度、熱性能等性能，并通過(guò)HPLC 測(cè)定了載油率，為魚(yú)明膠的應(yīng)用提供參考。

1 試驗(yàn)條件及方法

1.1 材料與儀器

金槍魚(yú)皮，寧波今日食品有限公司；鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、甲醇（色譜純），國(guó)藥化學(xué)試劑股份有限公司；胃蛋白酶，天津君安生物制藥有限公司；VE 醋酸酯，浙江新和成有限公司。

差示掃描量熱儀，DSC 214，德國(guó)NETZSCH；D8 X 射線衍射儀，德國(guó)Bruker；旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，上海精析有限公司；高效液相色譜儀，Aglient 1200，美國(guó)安捷倫；高壓均質(zhì)機(jī)，NanoGenizer，美國(guó)Genizer；激光粒度儀，Nanobrook Omni，美國(guó) Brookhaven；質(zhì)構(gòu)分析儀，SMS Plus3，英國(guó) SMS。

1.2 魚(yú)明膠制備方法

金槍魚(yú)皮去除鱗片和殘留的魚(yú)肉，剪碎后加入料液比為1:6 的水中，加入適量的十二烷基苯磺酸鈉和碳酸氫鈉，40 ℃脫脂2 h，充分水洗后備用。

A 型及B 型魚(yú)明膠的制備：取脫脂的金槍魚(yú)皮放入料液比為1:6 的水中，酸法所用HCL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%～1.0%，堿法所用NaOH 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%～1.2%，室溫預(yù)處理4 h 后在65 ℃提膠4 h，通過(guò)活性炭脫色除味后離心分離，取上清夜在40 ℃烘干后得到金槍魚(yú)明膠。

E 型魚(yú)明膠制備：取脫脂的金槍魚(yú)皮放入料液比為1:6 的水中，加入1 mol/L 的HCL 預(yù)處理12 h（每隔6 h 換液1 次），再加入0.5%～2.5%的胃蛋白酶（以干魚(yú)皮質(zhì)量計(jì)）反應(yīng)1.5 h 后，加熱到100 ℃使酶失活，然后在65 ℃提膠4 h，活性炭脫色除味后離心，上清液在40 ℃烘干至恒重，得到金槍魚(yú)明膠。

為了表述方便，分別將不同條件制備的魚(yú)明膠編號(hào)，酸法和堿法制備的魚(yú)明膠分別為A 型和B 型魚(yú)明膠，酶法制備的魚(yú)明膠為E 型魚(yú)明膠，如表1 所示。

表1 魚(yú)明膠樣品編號(hào)

1.3 魚(yú)明膠性能與結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 魚(yú)明膠粘度及凝膠強(qiáng)度

分別稱(chēng)取一定量的魚(yú)明膠，加入適量的溫水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的溶液，在25 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)量不同方法制備的魚(yú)明膠的粘度。

配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.67%的魚(yú)明膠溶液，在10 ℃恒溫16 h，凝膠后通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀測(cè)凝膠強(qiáng)度。 以直徑為12.7 mm 的平底柱塞壓入明膠凝膠表面4 mm 所需的力為明膠凝膠的強(qiáng)度。

1.3.2 DSC

干燥后的魚(yú)明膠在恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中平衡4 d（含水率7.5%），平衡條件為溫度25 ℃、濕度50%。稱(chēng)取不同方法制備的魚(yú)明膠6 mg 左右置于鋁坩堝中，通過(guò)DSC 測(cè)定樣品的熱性能，溫度范圍為20～120 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)鈿夥铡?/p>

1.3.3 XRD

魚(yú)明膠成膜干燥后，通過(guò)X 射線衍射儀分析魚(yú)明膠的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)，Cu 靶，掃描速度4 °/min，掃描范圍 5～40 °，采樣步寬 0.02 °。

1.4 魚(yú)明膠的乳化性

按質(zhì)量比1:1 稱(chēng)取魚(yú)明膠與VE 醋酸酯，先將魚(yú)明膠溶于60 ℃熱水中，然后在高速剪切時(shí)（12 000 r/min） 將VE 醋酸酯滴加到60 ℃的魚(yú)明膠溶液中， 滴加完畢后調(diào)節(jié)乳液pH 至6.0， 加入NaCL 使離子強(qiáng)度達(dá)到100 mM，剪切攪拌5 min 后制得油水比為1:40 的粗乳液，再通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)在20 000 psi 均質(zhì)3 次，25 ℃避光靜置24 h 后備用。

取 VE 醋酸酯 0.12 g 于 50 mL 容量瓶中，加入去離子水定容至 50 mL，再分別取 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL 于容量瓶中用甲醇稀釋至10 mL，取稀釋后的VE 甲醇溶液1 mL 通過(guò)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)VE 的出峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 流動(dòng)相為甲醇，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm。

取明膠/VE 醋酸酯乳液1 mL 于10 mL 容量瓶中，加入10%的胃蛋白酶0.1 mL，混合均勻后定容，37 ℃反應(yīng)60 min。 然后取1 mL 于容量瓶中用甲醇稀釋到10 mL，離心后取上清液1 mL，用甲醇稀釋30 倍。 稀釋后的溶液通過(guò)HPLC 分析VE 醋酸酯的出峰面積，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合公式計(jì)算VE 醋酸酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)，然后通過(guò)式（1）計(jì)算載油率。

式(1)中E 表示載油效率，wload表示由HPLC 測(cè)得的乳液中VE 的質(zhì)量，woli為加入乳液中VE 的總質(zhì)量。

明膠/VE 醋酸酯乳液用去離子水稀釋200 倍，取2 mL 到樣品池中，在25 ℃平衡2 min 后通過(guò)Nanobrook Omni 激光粒度儀測(cè)定乳液的粒徑分布，每個(gè)樣品測(cè)量3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠強(qiáng)度與粘度

按前述方法分別在不同條件下制備了金槍魚(yú)明膠，以干魚(yú)皮重為基準(zhǔn)計(jì)算產(chǎn)率并測(cè)定魚(yú)明膠的凝膠強(qiáng)度和粘度，結(jié)果如圖1 所示。 從圖1(a)可以看出，A 型和B 型魚(yú)明膠的產(chǎn)率隨著HCL 和NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加， 呈先升后降的趨勢(shì)。 當(dāng)HCL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)魚(yú)明膠產(chǎn)率達(dá)到最大值為44.2%，當(dāng)NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)魚(yú)明膠產(chǎn)率達(dá)到最大值為45.6%。 隨著酸堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加，膠原亞基被進(jìn)一步降解成小分子組分，更易浸出魚(yú)皮，隨著水洗液而流失，導(dǎo)致明膠產(chǎn)率下降[21]。 酶法制備魚(yú)明膠時(shí)，明膠產(chǎn)率隨酶用量的增大而增加，這是由于膠原蛋白分子比較緊密，適當(dāng)提高酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有助于促進(jìn)酶解反應(yīng)的完成，從而增大明膠產(chǎn)率，當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)產(chǎn)率為39.0%，比酸法和堿法制備的魚(yú)明膠產(chǎn)率略低[6]。

由圖1(b)和1(c)可知，A 型和B 型魚(yú)明膠凝膠強(qiáng)度和粘度也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，其中B 型魚(yú)明膠平均粘度和凝膠強(qiáng)度遠(yuǎn)高于A 型魚(yú)明膠，當(dāng)NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，B 型魚(yú)明膠的最大凝膠強(qiáng)度和粘度分別達(dá)到1 804.8 Bloom g 和150.0 mPa·s；當(dāng)HCL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，A 型魚(yú)明膠的最大凝膠強(qiáng)度和粘度分別達(dá)到692.0 Bloom g 和64.4 mPa·s。 由于酸堿處理破壞了魚(yú)膠原蛋白結(jié)構(gòu)，隨著酸堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大膠原蛋白水解程度增加，使膠原亞基在提膠過(guò)程中更易于溶出，從而得到粘度與凝膠強(qiáng)度更高的明膠，但當(dāng)酸堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高時(shí)，膠原進(jìn)一步降解，明膠中小分子含量增加，粘度和凝膠強(qiáng)度也隨之降低[21-22]。

圖1 制備條件對(duì)魚(yú)明膠性能的影響: (a)產(chǎn)率; (b)凝膠強(qiáng)度; (c)粘度

酶法制備的魚(yú)明膠凝膠強(qiáng)度隨酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低，粘度隨酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低，當(dāng)酶用量為1.5%時(shí)，凝膠強(qiáng)度達(dá)到最大值493.6 Bloom g，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的其它酶用量條件制得的明膠凝膠強(qiáng)度為220～250 Bloom g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于酸法和堿法制備的魚(yú)明膠。 這是由于隨著酶用量的增大，會(huì)加大膠原的水解程度，使得明膠分子量降低，從而使得其凝凍強(qiáng)度下降，并且水溶液中膠原的肽鏈纏結(jié)數(shù)目減少，使產(chǎn)物黏度也下降[23]。

2.2 熱性能

圖2(a)-(c)分別為A 型、B 型和E 型魚(yú)明膠的DSC 曲線，由圖2 DSC 曲線得到的數(shù)據(jù)列于表2中。從圖2 可以看出，明膠在升溫過(guò)程中出現(xiàn)了3 個(gè)吸熱峰，從低到高分別為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）、膠原的變性溫度（Tu）和明膠的熔融溫度（Tm）[17]。 從表2 可以看出，隨著酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，A 型魚(yú)明膠的Tg由48.0 ℃升高到54.2 ℃，高于文獻(xiàn)值，這是由于魚(yú)明膠水分含量不同所致，由于水對(duì)明膠有增塑作用，含水率的降低使魚(yú)明膠Tg升高[24-26]。B 型和E 型魚(yú)明膠的Tg受堿和酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較小，基本保持穩(wěn)定，酶法制備的魚(yú)明膠平均Tg較低。Tg表明了明膠分子鏈可以自由移動(dòng)的最低溫度，上述結(jié)果基本與明膠的平均粘度變化趨勢(shì)一致，平均粘度較大的B 型魚(yú)明膠的分子量較大，分子鏈自由運(yùn)動(dòng)需要更高的能量，Tg也更高。

魚(yú)明膠的Tu與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)[27]，由表2 可知，E 型魚(yú)明膠的Tu最低（平均為68.5 ℃），膠原蛋白的空間結(jié)構(gòu)更易發(fā)生轉(zhuǎn)變；B 型魚(yú)明膠的Tu最高（平均為79.6 ℃），膠原蛋白空間構(gòu)象更穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性更好，不易發(fā)生變性。

明膠的熔融溫度Tm為明膠的粘流溫度，由圖2(a)-(c)和表2 可以看出，魚(yú)明膠的Tm隨酸、堿、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)HCL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)制得的魚(yú)明膠Tm達(dá)到最大值，分別為149.0 ℃、177.3 ℃、162.1 ℃，與圖1(b)、圖1(c)中明膠的凝膠強(qiáng)度和粘度的變化趨勢(shì)一致。 隨著酸堿酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，膠原水解程度提高，得到的明膠分子量增大到最大值，明膠分子鏈的纏結(jié)使得Tm升高，而后隨酸堿酶用量繼續(xù)增大明膠水解，分子量又有所下降，Tm也隨之下降。

表2 魚(yú)明膠熱性能參數(shù)

圖2 魚(yú)明膠的DSC 曲線: (a)A 型魚(yú)明膠; (b)B 型魚(yú)明膠; (c)E 型魚(yú)明膠

由于膠原蛋白的降解程度不同，魚(yú)明膠實(shí)際上為不同大小分子組成的混合物，不同方法制備的魚(yú)明膠產(chǎn)品有差異，其中肽鏈的分子間相互作用也不同，導(dǎo)致其熱性能的差異，除制備方法外，具體的制備條件如溫度、時(shí)間和pH 等也會(huì)影響明膠性能，需要進(jìn)一步深入探討。

2.3 XRD

通過(guò)XRD 研究了不同制備條件對(duì)魚(yú)明膠聚集態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，如圖3(a)-(c)所示，可以看出A 型、B型和E 型魚(yú)明膠均在2θ=21.3°左右出現(xiàn)非晶衍射峰，為明膠的特征衍射峰，表明明膠呈無(wú)定型態(tài)，大部分膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)被破壞[20,28]。 B 型魚(yú)明膠除非晶峰外，B4 和B5 魚(yú)明膠在2θ=7.4°還出現(xiàn)了膠原蛋白的特征峰，表明在NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%和1.2%時(shí)制備的魚(yú)明膠保留了部分三螺旋結(jié)構(gòu)；酶法制備的魚(yú)明膠在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%和1.0%時(shí)，在2θ=21.3°具有很強(qiáng)的明膠非晶衍射峰，并且酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)在2θ=7.4°出現(xiàn)了三螺旋結(jié)構(gòu)的衍射峰， 當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%～2.5%時(shí)在2θ=17.3°出現(xiàn)新的衍射峰，明膠的非晶峰位置偏移，表明隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，制備的魚(yú)明膠分子間交聯(lián)程度降低，明膠聚集態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

圖3 魚(yú)明膠的XRD 圖: (a)A 型魚(yú)明膠; (b)B 型魚(yú)明膠; (c)E 型魚(yú)明膠

2.4 魚(yú)明膠乳液

2.4.1 HPLC

VE 醋酸酯的HPLC 曲線如圖4 所示，可以看出VE 醋酸酯在26.5 min 出峰。 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的VE醋酸酯通過(guò)HPLC 測(cè)出峰面積，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合公式為：y=4.079×106x+60.23

圖4 VE 醋酸酯溶液的HPLC 曲線

2.4.2 魚(yú)明膠載油率及乳液平均粒徑

按前述方法分別制備A 型、B 型及酶法魚(yú)明膠/VE 醋酸酯乳液，通過(guò)HPLC 測(cè)定載油率，結(jié)果如表3所示。從表3 可以看出，A 型魚(yú)明膠的載油率隨HCL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而升高；當(dāng)HCL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1.0%時(shí)，魚(yú)明膠的載油率僅約10%左右，當(dāng)HCL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)載油率達(dá)到41.7%，乳液粒徑隨著HCL質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大從590.8 nm 降至355.5 nm。 B 型魚(yú)明膠的載油率隨NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.4%增加到1.0%時(shí)制得的魚(yú)明膠載油率從8.8%提高到20.9%，NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%時(shí)又降至14.2%；乳液粒徑隨NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減小。 酶法制備E 型的魚(yú)明膠載油率隨酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈降低趨勢(shì)，當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.5%增大到2.5%時(shí)載油率由19.6%降至5.8%；乳液粒徑隨酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈降低趨勢(shì)。

表3 魚(yú)明膠/VE 醋酸酯乳液的性能

綜上所述，在相同乳化條件下，酸法制備的A 型魚(yú)明膠最大載油率遠(yuǎn)高于堿法和酶法制備的B 型和E 型魚(yú)明膠，其中E 型魚(yú)明膠載油率最低，乳化效果較差。 有研究表明，膠原蛋白的分子量對(duì)其乳化性有一定的影響，而魚(yú)明膠的粘度反映了其分子量的變化規(guī)律，通過(guò)與圖1(c)比較，發(fā)現(xiàn)魚(yú)明膠的載油率與其粘度的變化趨勢(shì)基本一致，高粘度的魚(yú)明膠由于分子量大分子鏈較長(zhǎng)，分子鏈呈無(wú)規(guī)卷曲，分子間相互交聯(lián)暴露出相對(duì)多的親油基團(tuán)，將油相包埋在明膠相內(nèi)，表現(xiàn)出有更好的乳化性[29]。

3 結(jié)論

論文研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)酸、堿、酶制備的金槍魚(yú)明膠的結(jié)構(gòu)與性能，可以得出以下結(jié)論：

（1）經(jīng)酸、堿、酶處理后得到無(wú)定形態(tài)的魚(yú)明膠，大部分膠原的三股螺旋構(gòu)象被破壞。

（2）制備方法和制備條件對(duì)魚(yú)明膠產(chǎn)率、凝膠強(qiáng)度、粘度和熱性能等有一定的影響。 酸法和堿法制備的魚(yú)明膠產(chǎn)率高于酶法；B 型魚(yú)明膠的凝膠強(qiáng)度和粘度遠(yuǎn)高于A 型和E 型魚(yú)明膠，且熱穩(wěn)定性?xún)?yōu)于A型和E 型魚(yú)明膠。

（3）用作乳化劑時(shí)，酸法制備的A 型魚(yú)明膠乳化VE 醋酸酯的平均載油率高于B 型和E 型魚(yú)明膠。