吳丹，耿爽，胡軼

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 湖北 武漢 430014）

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌的80%[2]。隨著早期診斷和治療方式的改進(jìn)，NSCLC發(fā)病率有所下降，但5年生存率仍不盡人意[3]。尋找新的預(yù)后標(biāo)志物，對改善NSCLC 預(yù)后尤為重要[4-5]。P2X7 受體是由位于12q24.31 位點(diǎn)的P2X7基因編碼的細(xì)胞膜外受體蛋白，相對分子質(zhì)量約為120 kD，屬于P2X 受體家族成員，可由細(xì)胞外三磷酸腺苷激活[6-7]。P2X7R 與多種腫瘤遷移、侵襲及預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。在胰腺癌中，P2X7R 表達(dá)可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞存活和遷移，采用P2X7R 變構(gòu)抑制劑可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移[10-11]。然而P2X7R 在NSCLC 中的表達(dá)及預(yù)后鮮見報(bào)道且不完全[12-13]。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測NSCLC 患者癌組織中 P2X7R 的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月—2014年1月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院行肺癌切除術(shù)的118 例患者組織標(biāo)本。所有病理標(biāo)本在納入研究前經(jīng)2 位病理醫(yī)師根據(jù)NSCLC 病理分期（TNM 分期第8 版）標(biāo)準(zhǔn)[14]重新確認(rèn)，共30 例患者接受術(shù)前新輔助化學(xué)治療（以下簡稱化療）。術(shù)后患者均按美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national comprehensive cancer network, NCCN）指南進(jìn)行后續(xù)化療，未接受分子靶向治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均接受NSCLC 切除術(shù)；除NSCLC 外，不存在其他部位的惡性腫瘤；有完整的臨床病歷資料和隨訪信息；按照NCCN 指南原則進(jìn)行治療。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集從患者病歷資料中提取臨床病理資料，包括患者性別、年齡、吸煙狀況、腫瘤大小、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期。

1.2.2 隨訪總生存時(shí)間定義為從術(shù)后至隨訪截止日或患者死亡時(shí)間的間隔。無瘤生存時(shí)間定義為從術(shù)后到首次隨訪發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或隨訪截止日的間隔。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

將甲醛固定、石蠟包埋的病理組織切成4μm 厚切片，隨后將組織切片脫石蠟并在梯度乙醇中脫水。在pH 6.0 的乙二胺四乙酸緩沖液（武漢博士德生物公司）中煮沸3 min 行抗原修復(fù)。用3%過氧化氫（武漢博士德生物公司）淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性30 min。使用P2X7R 單克隆抗體（英國Abcam 公司）在4℃條件下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶綴合的二抗（美國Sigma-Aldrich 公司）在37℃條件下孵育2 h，用辣根過氧化物酶和3，3'-二氨基聯(lián)苯胺色原溶液（武漢博士德生物公司）處理載玻片并用蘇木精復(fù)染。

1.4 免疫組織化學(xué)評(píng)分

通過評(píng)估染色強(qiáng)度和密度來確定免疫組織化學(xué)評(píng)分：采用陽性細(xì)胞百分比結(jié)合染色強(qiáng)度對P2X7R表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分為陰性；1 分為弱陽性；2 分為中度陽性；3 分為強(qiáng)陽性。P2X7R 陽性細(xì)胞的百分比評(píng)分：1 分為0%～10%；2 分 為＞10% ～50%；3 分 為＞50% ～80%；4 分為＞80%～100%。將兩者得分相乘，計(jì)算出總得分，分值從0 ～12 不等?？偟梅帧? 分為P2X7R 低表達(dá)；≥4 分為P2X7R 高表達(dá)。其中，P2X7R 低表達(dá)組46 例，高表達(dá)組72 例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型用于預(yù)后分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白的表達(dá)

NSCLC 組織中P2X7R 蛋白陽性染色主要定位于NSCLC 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，72 例（61.0%）癌組織中P2X7R 呈高表達(dá)；46 例（39.0%）癌組織中P2X7R 呈低表達(dá)。見圖1。

圖1 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×400）

2.2 不同影響因素下P2X7R 蛋白高表達(dá)率比較

不同性別、年齡、腫瘤大小、吸煙狀態(tài)、組織學(xué)類型、術(shù)前新輔助化療及術(shù)后化療患者的P2X7R 蛋白高表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而不同TNM 分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的P2X7R 蛋白高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 NSCLC 組織中P2X7R 蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，P2X7R 高表達(dá)組與低表達(dá)組無瘤生存率及總生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.687 和14.687，均P=0.000），P2X7R 高表達(dá)組均低于P2X7R低表達(dá)組。P2X7R 高表達(dá)組5年無瘤生存率為18.1%，P2X7R 低表達(dá)組5年無瘤生存率為25.1%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.254，P=0.000），P2X7R 高表達(dá)組低于P2X7R 低表達(dá)組。P2X7R 高表達(dá)組5年總生存率為23.3%，P2X7R 低表達(dá)組5年總生存率為30.1%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.721，P=0.000），P2X7R 高表達(dá)組低于P2X7R 低表達(dá)組。見圖2。

表1 不同影響因素下P2X7R 蛋白高表達(dá)率比較（n =118）

2.4 影響NSCLC 患者無瘤生存率的單因素和多因素分析

單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，P2X7R 表達(dá)、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC 患者無瘤生存率的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析表明，P2X7R 表達(dá)及TNM 分期是影響NSCLC 患者無瘤生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表2。

圖2 P2X7R 高、低表達(dá)組無瘤生存率和總生存率比較

表2 多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響患者無瘤生存率的因素參數(shù)

2.5 影響NSCLC 患者總生存率的單因素和多因素分析

單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，P2X7R 表達(dá)、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC 患者總生存率的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析表明，P2X7R 表達(dá)及TNM 分期是影響NSCLC 患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表3。

表3 多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響患者總生存率的因素參數(shù)

3 討論

在我國肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的第1 位[15]，相對于西方發(fā)達(dá)國家，我國NSCLC 病死率更高，且呈逐年上升趨勢[16-17]。P2X7R 在人體多種細(xì)胞中表達(dá)，其中以干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最為顯著，參與調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡、代謝及吞噬[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，118 例患者中61.0%的患者P2X7R呈高表達(dá)；39.0%患者P2X7R 呈低表達(dá)，這與最近報(bào)道結(jié)果類似[19]。有學(xué)者采用免疫組織化學(xué)和聚合酶鏈反應(yīng)檢測94 例結(jié)直腸癌中P2X7R 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)51 例，低表達(dá)43 例，結(jié)果顯示在不同腫瘤組織中P2X7R 存在表達(dá)差異[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC 組織中的P2X7R 表達(dá)水平與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤大小、吸煙狀態(tài)及組織學(xué)類型無關(guān)。BOLDRINI 等[13]報(bào)道，并未發(fā)現(xiàn)P2X7R 蛋白表達(dá)與臨床病理因素有相關(guān)性，原因可能與其研究所用的樣本量偏少及病理類型的異質(zhì)性有關(guān)。

有研究報(bào)道，NSCLC 的TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者疾病嚴(yán)重程度和腫瘤細(xì)胞侵襲性密切相關(guān)[4]。上述結(jié)果顯示，P2X7R 高表達(dá)的NSCLC 患者惡性程度更高。通過Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，P2X7R高表達(dá)的NSCLC 患者預(yù)后劣于P2X7R 低表達(dá)患者。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析提示，P2X7R 表達(dá)為影響無瘤生存率和總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。BOLDRINI 等[12]報(bào)道，P2X7R mRNA 的表達(dá)與NSCLC 預(yù)后相關(guān)，P2X7R mRNA 高表達(dá)的NSCLC 患者預(yù)后不良，與本研究結(jié)果類似。有文獻(xiàn)報(bào)道，在結(jié)直腸癌患者中P2X7R 高表達(dá)為影響結(jié)直腸癌術(shù)后患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19]。盡管文獻(xiàn)報(bào)道在乳腺癌和前列腺癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)P2X7R 表達(dá)增強(qiáng)，但并沒有P2X7R 表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的報(bào)道[20-22]。

P2X7R 高表達(dá)導(dǎo)致NSCLC 臨床預(yù)后不佳的機(jī)制尚不清楚。其機(jī)制可能為：①在體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞系中P2X7R 通過激活三磷酸腺苷參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）[20]，而EMT 是NSCLC 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟[21]，P2X7R 可能通過影響EMT 而影響NSCLC 的進(jìn)展；②P2X7R高表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，在體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系中，P2X7R 高表達(dá)或沉默分別促進(jìn)或抑制乳腺癌細(xì)胞增殖能力[22]；③新血管形成是大多數(shù)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的先決條件，在胰腺癌模型中發(fā)現(xiàn)P2X7R高表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中新生血管形成[23-24]，其是否通過促進(jìn)腫瘤血管生成參與腫瘤進(jìn)展值得進(jìn)一步研究。

本研究為單中心的回顧性研究，納入病例數(shù)較少，尚需要多中心大樣本研究來證實(shí)本研究結(jié)論；同時(shí)P2X7R 影響NSCLC 患者預(yù)后的分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 組織中P2X7R高表達(dá)與患者惡性臨床病理特征及預(yù)后不良相關(guān)，P2X7R 高表達(dá)是NSCLC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。