楊宇華 黃 艷 鄭偉鵬

(武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300)

艾草又名蘄艾、灸草，為菊科蒿屬多年野生草本植物[1]。艾草有較豐富的藥用價(jià)值，如抑菌、抗過敏、止血、鎮(zhèn)痛[2-3]。艾草的藥理作用與其獨(dú)特的天然生物活性成分黃酮息息相關(guān)，可有效提高機(jī)體免疫力，降低冠心病、高血壓、急慢性肝炎和心肌缺血損傷等疾病的發(fā)病率[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾草、雞胸肉：市售；

無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、焦性沒食子酸、1,10-菲啰啉、乙二胺四乙酸、氧化鐵、乙酸鉛、抗壞血酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、雙氧水、磷酸二氫鉀、甲基紅、亞甲基藍(lán)、硼酸、氫氧化鈉、三氯甲烷：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸：優(yōu)級(jí)純，西隴化工股份有限公司；

三(羥甲基)氨基甲烷、2-硫代巴比妥酸：生物試劑級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基：生物試劑級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)：PW80型，天津市泰斯特儀器有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9123型，上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-DⅢ型，鞏義市予華儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗機(jī)：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：Neofuge 15R型，上海力申科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE 2000A型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機(jī)：FD-1D-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

恒流泵：HL-2型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

可見光分光光度計(jì)：V-1100D型，上海美普達(dá)有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-3200PC型，上海美普達(dá)有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-S4型，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器公司：

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-101S型，常州邁科諾科技有限公司；

酸度計(jì)：PB-10型，上海多博科學(xué)儀器有限公司；

全溫培養(yǎng)搖床：QYC-200型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)：WSC-S型，上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；

高壓均質(zhì)器：Scientz-150型，寧波新芝有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

(1) 艾草：80 ℃烘干，粉碎，過60目篩，得艾草粉末，再60 ℃烘干至恒重后保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 艾草黃酮提取：參照楊宇華等[8]優(yōu)化的超聲波輔助提取工藝條件提取艾草總黃酮，得艾草粗提物，收集備用。

(3) 艾草黃酮純化：根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)，采用大孔吸附樹脂，按上樣液濃度2.5 mg/mL，上樣液pH值4，吸附溫度20 ℃，上樣速度1.5 mL/min，選用80%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫流速1.5 mL/min，洗脫用量100 mL的條件進(jìn)行純化處理。取濾液濃縮后，置于超低溫冰箱24 h后，真空冷凍干燥約24 h，得到純化艾草黃酮干品，留存?zhèn)溆谩?/p>

(4) 保鮮液制備：將艾草黃酮純化物和抗壞血酸分別配制成水溶液，其質(zhì)量濃度為0.1～0.5 mg/mL，備用。

(5) 肉樣處理：雞胸肉冷卻排酸24 h，使其中心溫度降至0～4 ℃，于超凈工作臺(tái)將其分成約200 g的肉塊，去除筋膜和多余脂肪，平均分成6組，每組3塊，待用。將處理好的6組肉塊分別用0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的黃酮純化物溶液浸泡，10 min后取出，瀝干后用保鮮袋包裝，置于(4±1) ℃冰箱中，定期(第0，2，4，6，8天)對(duì)冷卻雞胸肉的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

斯大林時(shí)期與勃列日涅夫時(shí)期特權(quán)階層的使命是不同的，斯大林時(shí)期“特權(quán)階層”的主要使命是維護(hù)、鞏固斯大林的體制模式；而勃列日涅夫時(shí)期，特權(quán)階層的主要使命是抵制各種實(shí)質(zhì)性的改革，維護(hù)現(xiàn)狀，使斯大林式的社會(huì)主義更加“成熟”。這也是這個(gè)時(shí)期體制改革停滯不前的一個(gè)重要因素。

1.3.2 艾草黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

(1) 總還原能力的測(cè)定：采用普魯士蘭法[9]。取1.00 mL 樣液，依次加入pH 6.6的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、1% K3[Fe(CN)6]溶液各2.5 mL，搖勻后將其置于50 ℃水浴20 min后加入2.5 mL 10%的三氯醋酸溶液，搖勻。取混合液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL，與0.5 mL 0.1% FeCl3溶液混合。靜置10 min后于700 nm處測(cè)定吸光度。吸光值與還原能力呈正相關(guān)。

(1)

式中：

A0——空白組的吸光度值；

A——樣品組的吸光度值。

(2)

式中：

C——·OH清除率，%；

A樣品——加抗氧化劑及過氧化氫的溶液的吸光值；

A損傷——加過氧化氫而不加抗氧化劑的溶液的吸光值；

A未損——兩者都不加的溶液的吸光值。

(4) DPPH自由基(DPPH·)清除率的測(cè)定：參照賈靖霖等[12]的方法，根據(jù)實(shí)際情況稍作修改。移取4 mL pH 6.86標(biāo)準(zhǔn)混合磷酸鹽緩沖液注入10 mL試管中，加入2×10-4mol/L DPPH溶液(95%乙醇配制) 4 mL，搖勻。加樣液1.00 mL，以蒸餾水定容至10.00 mL刻度，混勻，室溫下靜置10 min于520 nm處測(cè)定吸光度(95%乙醇作參比)。按式(3)計(jì)算DPPH·清除率。

(3)

式中：

C——DPPH·清除率，%；

Ai——加樣液后DPPH溶液的吸光值；

Aj——不加DPPH，只加樣液和水的溶液的吸光值；

Ac——不加樣液，只加DPPH及水的溶液的吸光值。

1.3.3 艾草黃酮應(yīng)用于雞胸肉保鮮試驗(yàn)

(1) pH值的測(cè)定：稱取5 g樣品，加入50 mL蒸餾水，利用Scientz-150高壓均質(zhì)器室溫下均質(zhì)25 s，pH計(jì)測(cè)定[13]。

(2) 感官評(píng)價(jià)：對(duì)雞肉的色澤、彈性、氣味采用4級(jí)評(píng)分法評(píng)分[14]。感官評(píng)價(jià)表見表1。

(3) 硫代巴比妥酸值(TBARS值)的測(cè)定：參照楊新磊等[15]的方法，根據(jù)實(shí)際情況稍作修改。取10 g雞胸肉研細(xì)，加入7.5% TCA (含0.1%乙二胺四乙酸) 50 mL，連續(xù)震搖30 min后雙層濾紙過濾。取5 mL上清液，加0.02 mol/L TBARS溶液5 mL，90 ℃下水浴40 min，冷卻l h后離心5 min，上清液中加入5 mL氯仿?lián)u勻，靜置分層取上清液分別在532 nm和600 nm處比色，記錄消光值。與TBARS反應(yīng)的物質(zhì)的量以每千克肉中丙二醛(MDA)的毫克數(shù)來表示。按式(4)計(jì)算TBARS值。

(4)

式中：

TBARS——硫代巴比妥酸值，mg/100 g；

A532 nm——532 nm處的吸光度值；

A600 nm——600 nm處的吸光度值。

(4) 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N值)的測(cè)定：按GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》執(zhí)行。

(5) 色差的測(cè)定：利用WSC-S測(cè)色色差計(jì)測(cè)定肉樣的a(紅度)值，儀器使用前分別用黑色陷阱和白板進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，按照操作選擇合適的試皿，將肉樣鋪滿試皿底部，置于樣臺(tái)上測(cè)量，每個(gè)樣品隨機(jī)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。從第0天開始計(jì)算，每隔1天測(cè)量一次并記錄數(shù)據(jù)。

表1 雞胸肉冷藏期間的感官評(píng)價(jià)

(6) 硫化氫(H2S)檢驗(yàn)：采用醋酸鉛濾紙法檢測(cè)[16]。肉粒置于錐形瓶中，放入量為錐形瓶的1/3。將乙酸鉛堿性溶液處理過濾紙條懸掛于瓶中，塞緊瓶塞。室溫下靜置15 min，觀察濾紙條的顏色變化。硫化氫檢驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

運(yùn)用Excel 2016統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)及計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，應(yīng)用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾草黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

2.1.1 總還原力 由圖1可知，在選定的濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，黃酮純化物、抗壞血酸的吸光度皆變大，總體呈較好的線性關(guān)系，表明該物質(zhì)具有一定的還原力，且吸光度值越大，總還原能力越強(qiáng)，其抗氧化性也越高。在同一質(zhì)量濃度下，雖黃酮純化物總體較弱于抗壞血酸，但在一定濃度下，黃酮純化物可替代抗壞血酸。

表2 硫化氫檢驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)

圖1 黃酮純化物、抗壞血酸的總還原力

圖2 黃酮純化物、抗壞血酸對(duì)的清除作用

2.1.3 對(duì)·OH的清除作用 由圖3可知，艾草黃酮純化物、抗壞血酸對(duì)·OH的清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度<0.2 mg/mL時(shí)，抗壞血酸清除率增幅較強(qiáng)于黃酮純化物；當(dāng)質(zhì)量濃度>0.2 mg/mL時(shí)，抗壞血酸清除率增幅減緩，黃酮純化物清除率增幅反而增大；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時(shí)，黃酮純化物對(duì)·OH的清除率達(dá)到77%，而抗壞血酸的清除率為74.5%，表明當(dāng)質(zhì)量濃度>0.4 mg/mL時(shí)，黃酮純化物對(duì)·OH的清除率大于抗壞血酸。

2.1.4 對(duì)DPPH·的清除作用 由圖4可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度的艾草黃酮純化物與抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率均呈上升趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量濃度<0.2 mg/mL 時(shí)，抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率增幅較強(qiáng)，而黃酮純化物對(duì)DPPH·的清除率增幅則較緩；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2～0.4 mg/mL 時(shí)，黃酮純化物清除率增幅高于抗壞血酸；當(dāng)質(zhì)量濃度>0.4 mg/mL時(shí)，抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率趨于平緩接近無增長(zhǎng)，艾草黃酮對(duì)DPPH·的清除率增幅雖有所下降但仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH·清除能力。

圖3 黃酮純化物、抗壞血酸對(duì)·OH的清除作用

圖4 黃酮純化物、抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除作用

2.2 艾草黃酮應(yīng)用于雞胸肉保鮮試驗(yàn)

2.2.1 不同質(zhì)量濃度艾草黃酮對(duì)肉樣pH值的影響 由圖5可知，整個(gè)貯藏期間，各組分pH值總體均呈上升趨勢(shì)，是由于肉中的蛋白質(zhì)在微生物的作用下被分解成氨、三甲胺等堿性物質(zhì)，促使pH值逐漸增大[17-18]。貯藏時(shí)間為0 d時(shí)，空白組與對(duì)照組pH值無顯著差異；貯藏2 d后，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，除空白對(duì)照組外，經(jīng)艾草黃酮溶液處理后的樣品pH值增幅趨勢(shì)較緩，且質(zhì)量濃度與pH值呈負(fù)相關(guān)，在一定程度上表明艾草黃酮提取液對(duì)冷卻肉的貯藏具有一定的抑菌作用和保鮮效果；貯藏4 d后，濃度0.5 mg/mL的艾草黃酮純化物處理液的pH值最低，表明在所考察的范圍內(nèi)，艾草黃酮質(zhì)量濃度越高，保鮮效果越好。

2.2.2 不同質(zhì)量濃度艾草黃酮對(duì)肉樣感官品質(zhì)的影響

由表3可知，貯藏過程中，對(duì)照組與處理組，其感官品質(zhì)總體均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。其中，空白對(duì)照組在整個(gè)貯藏期間感官品質(zhì)變化最為明顯，其在第2天時(shí)，氣味開始變化，其余組分感官品質(zhì)均無變化，隨著貯藏時(shí)間的增加，各處理組感官品質(zhì)變化趨勢(shì)有所減緩。貯藏第8天時(shí)，空白對(duì)照組感官品質(zhì)低于各處理組分，表明在貯藏期間艾草黃酮純化物在一定程度上抑制了冷卻肉感官品質(zhì)的降低，達(dá)到一定的保鮮效果。

圖5 雞胸肉貯藏期間pH值變化

表3 艾草黃酮濃度對(duì)貯藏期間雞胸肉感官品質(zhì)的影響

2.2.3 不同質(zhì)量濃度艾草黃酮對(duì)肉樣TBARS值的影響

由圖6可知，相同貯藏時(shí)間內(nèi)，添加組雞胸肉TBARS值均低于空白組，且隨著黃酮添加量增大，對(duì)應(yīng)的雞胸肉TBARS值越小，表明艾草黃酮純化物具有一定的抗氧化作用，且隨質(zhì)量濃度越大，抗氧化效果越佳。在0～8 d時(shí)，空白組、添加0.1，0.2，0.3 mg/mL的艾草黃酮純化物，對(duì)應(yīng)雞胸肉TBARS值呈不斷上升趨勢(shì)，繼續(xù)延長(zhǎng)貯藏時(shí)間，TBARS值下降并趨于平緩，可能是由于雞胸肉中的丙二醛作為氧化的中間產(chǎn)物被氧化為有機(jī)酸，導(dǎo)致丙二醛無法繼續(xù)與TBARS反應(yīng)[19-20]。

2.2.4 不同質(zhì)量濃度艾草黃酮對(duì)肉樣TVB-N值的影響

由圖7可知，處理組與空白對(duì)照組隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N值逐漸增加，可能是肉品被侵染或肉本身含有的微生物引起蛋白質(zhì)脫羧、脫氨等作用產(chǎn)生堿性物質(zhì)[21]。第4天，空白組、0.1 mg/mL處理組和0.2 mg/mL處理組的TVB-N值均已超過GB/T 9959.2—2008 限定值(15.00 mg/100 g)，表明雞胸肉開始出現(xiàn)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，而0.3，0.4，0.5 mg/mL處理組均未超過國(guó)標(biāo)限定值。第8天時(shí)，空白組TVB-N值達(dá)到39.08 mg/100 g，各黃酮純化物處理組顯著低于空白組，表明黃酮純化物在雞胸肉冷藏期間可抑制微生物與酶的作用，減緩其腐敗變質(zhì)速度。整個(gè)貯藏過程中，肉中TVB-N值的總體變化趨勢(shì)為先緩慢增大后急劇增大，這主要是由于前期肌肉收縮產(chǎn)生的肌漿蛋白酶促進(jìn)蛋白質(zhì)水解，以及后期的微生物降解[22-23]；隨著黃酮純化物質(zhì)量濃度的增大，揮發(fā)性鹽基氮含量增大的趨勢(shì)有所下降，且0.4 mg/mL處理組與0.5 mg/mL處理組無明顯差異。從綜合效益分析，選擇濃度為0.4 mg/mL的艾草黃酮純化物為最佳質(zhì)量濃度。

圖6 雞胸肉貯藏期間TBARS值變化

圖7 雞胸肉貯藏期間TVB-N值變化

2.2.5 不同質(zhì)量濃度艾草黃酮對(duì)肉樣紅度值的影響a值越大肉色越紅，表明肉類被氧化的程度較小[24]。由圖8 可知，各試驗(yàn)組的紅度值在貯藏期間均逐漸減小。貯藏2 d 后，各處理組的紅度值均高于空白對(duì)照組，其變化趨勢(shì)也較空白對(duì)照組緩慢。整個(gè)貯藏期間，0.5 mg/mL處理組艾草黃酮純化物溶液的雞胸肉紅度值，其a值由原來的17.28變?yōu)?0.65，下降了6.63；而空白對(duì)照組的a值由原來的15.13變?yōu)?.63，下降了10.50，其變化趨勢(shì)顯著高于黃酮純化物處理過的雞胸肉，表明艾草黃酮純化物有明顯延緩其色澤變化的效果。

2.2.6 不同質(zhì)量濃度艾草黃酮對(duì)肉樣硫化氫檢驗(yàn)的影響

由表4可知，整個(gè)貯藏期間，經(jīng)艾草黃酮純化物處理的樣品能有效控制冷肉在冷藏過程中硫化氫的產(chǎn)生，表明艾草黃酮純化物在一定程度上可有效抑制冷卻肉的腐敗。

3 結(jié)論

體外抗氧化試驗(yàn)表明，艾草黃酮純化物具有良好的體外抗氧化能力。艾草黃酮純化物有一定的還原力，且還原力隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基均具有清除能力，但都弱于抗壞血酸。

圖8 雞胸肉貯藏期間紅度值變化

表4 雞胸肉貯藏期間硫化氫變化

雞胸肉各理化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果表明，艾草黃酮純化物對(duì)雞胸肉保鮮效果較強(qiáng)于空白對(duì)照組，可有效抑制雞胸肉中微生物的繁殖和脂質(zhì)的氧化。艾草黃酮純化物多濃度梯度的保鮮對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 和0.5 mg/mL 時(shí)，艾草黃酮保鮮液對(duì)雞胸肉的保鮮效果無明顯差異。從生產(chǎn)效益成本分析，濃度過高導(dǎo)致成本增加，不適于生產(chǎn)應(yīng)用，因此，艾草黃酮純化物的最佳質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL。艾草黃酮純化物可有效抑制雞胸肉中微生物生長(zhǎng)速度，延緩腐敗等特征的產(chǎn)生，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品加工及肉制品的保鮮。