戴麗娟, 丁樂明，李韙韜，錢志余

1. 南通大學機械工程學院，江蘇 南通 226019 2. 南京航空航天大學生物醫(yī)學工程系，江蘇 南京 210016

引 言

盡管數(shù)十年來神經(jīng)成像技術的發(fā)現(xiàn)揭示了大腦各種功能背后豐富而復雜的過程，但使用神經(jīng)成像作為量化或測量疼痛的客觀工具仍受到質(zhì)疑。 這是因為疼痛是一種多因素的主觀體驗，在疼痛的處理過程中，包含一個大的分布式腦網(wǎng)絡，從而導致神經(jīng)成像信號的準確性和有效性有限[1-5]。

最近一些使用功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging, fMRI)的研究證實，源自局部脫氧血紅蛋白濃度變化的BOLD信號因痛覺而改變[6-9]。 類似地，一些使用功能近紅外光譜成像(functional near infrared imaging, fNIRI)的人類研究表明，熱刺激或電刺激會導致不同腦區(qū)血紅蛋白濃度的變化[10-13]。 因此，了解腦功能活動中神經(jīng)-血管耦合的性質(zhì)將有助于更好的量化或測量疼痛。

為了研究不同深度神經(jīng)核團在疼痛處理中相關的神經(jīng)-血管耦合問題，利用一種簡單的穩(wěn)態(tài)光纖光譜儀和光源-檢測距離小的Y型雙光纖微創(chuàng)探頭對大鼠前扣帶回在疼痛過程中的散射光譜進行實時采集，基于改進的Beer-Lambert定律(MBLL)獲得血流動力學參數(shù)，同時，采集大鼠前扣帶回的局部放電信號進行功率強度變化分析，確認血流動力學參數(shù)在疼痛過程中的變化與前扣帶回的功能激活相關，從而評估這種技術作為疼痛測量方式和增進對疼痛相關的腦血管功能的了解的可行性。

1 實驗部分

1.1 動物準備

選用7只成年雄性SD大鼠，平均年齡(98.5±1.5) d，平均體重(363.4±11.2) g，所有動物均經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉(50 mg·kg-1)。 將PE10導管插入頸靜脈，以0.02 mL·min-1的固定速率持續(xù)靜脈注射戊巴比妥鈉(5 mg·mL-1)，從而在整個數(shù)據(jù)采集過程中維持麻醉。 將大鼠頭部固定在腦立體定位儀上，通過使用反饋控制加熱毯將大鼠體溫保持在37 ℃。 沿頭皮中線切開，暴露前扣帶回上方的頭骨，通過顱骨鉆三個孔，根據(jù)大鼠腦立體圖譜中前扣帶回的范圍，選擇孔1坐標為前囟前1.44 mm、中線右側0.4 mm，孔2坐標為前囟后0.6 mm、中線右側0.6 mm。 孔3用于安裝地線螺釘，選擇在孔2附近的合適位置即可。

1.2 裝置

實驗系統(tǒng)結構如圖1所示，由光譜采集裝置和腦局部電信號采集裝置組成。 光譜采集裝置的基本組成部分是鎢鹵素光源(HL2000HP，Ocean Optics Inc.，Dunedin，F(xiàn)L，USA)、光纖光譜儀(USB 2000，Ocean Optics，Dunedin，F(xiàn)L，USA)、雙光纖探頭和用于控制和數(shù)據(jù)采集的計算機。 雙光纖探頭包含兩根多模光纖，一根用于光傳輸，另一根用于光檢測。 每根光纖直徑均為200 μm，兩纖芯距離400 μm，探頭尖端的外徑為1 mm。 腦局部電信號采集裝置主要由微電極、無線生物電記錄器和用于數(shù)據(jù)采集的計算機組成。

圖1 系統(tǒng)結構圖

1.3 數(shù)據(jù)采集和處理

將雙光纖探頭經(jīng)孔1放置于ACC上方，由探測光纖傳回的光信號經(jīng)光譜儀傳回電腦，使用LabWindows編程軟件記錄350～1 000 nm的散射光譜，采樣頻率2 Hz。 將微電極經(jīng)孔2插入ACC內(nèi)部，植入深度約3 mm。 地線螺釘插入孔3，用牙科膠固定微電極和螺釘。 經(jīng)微電極采集的腦局部電信號送入無線傳輸模塊，經(jīng)放大、A/D轉(zhuǎn)換后以無線方式傳輸給電腦，數(shù)據(jù)采集程序由LabView編寫，采樣頻率500 Hz。

實驗開始后，先記錄10 min的基線數(shù)據(jù)，然后向大鼠左后肢足底中心注射0.1 mL福爾馬林溶液(濃度3%)以產(chǎn)生疼痛。 數(shù)據(jù)采集保持至注射后60 min。 數(shù)據(jù)采集完成后，選擇500～600 nm 波段的光譜進行Δ[HbO]和Δ[Hb]的計算。 對采集的電信號，用MatLab編程進行分割，10 s為一時間段，計算每段數(shù)據(jù)β波頻段(13～30 Hz)的功率強度。

1.4 血流動力學參數(shù)相對變化估算法

生物組織光學常用擴散近似模型研究光(包括近紅外光)在生物組織中的傳播，但當光源與探測器距離小于1 mm時，擴散模型是無效的。 Zonios等對這一問題提出了解析的反射模型，但需要經(jīng)過嚴格的最小二乘擬合，耗時較長，限制了其在實時、隨時間變化的測量中的使用[14-15]。 本文采用以下算法來估計氧合血紅蛋白濃度[HbO]、脫氧血紅蛋白濃度[Hb]和總血紅蛋白濃度[HbT]的變化。 該算法基于修正的Beer-Lambert定律，假設水和除血紅蛋白衍生物外的其他吸光色團不隨時間變化，則可以通過下式將光強變化ΔOD(λ)與色團濃度的變化Δ[HbO]和Δ[Hb]聯(lián)系起來。

(1)

原則上，兩個波長點的數(shù)據(jù)就足夠計算式(1)的兩個未知量(Δ[HbO]和Δ[Hb])。 為了消除實驗噪聲，增加擬合精度，在500～595 nm范圍內(nèi)使用90個波長點來確定Δ[HbO]和Δ[Hb]的值，相鄰波長點光譜分辨率約1 nm。 Δ[HbT]等于Δ[HbO]與Δ[Hb]的和。

圖2 兩種測量方法測得的Δ[HbO]和Δ[Hb]的比較Fig.2 Comparisons of Δ[HbO] and Δ[Hb] obtained by two methods

利用懸乳液和血液的混合液體模型進行以上算法的驗證。 通過在液體模型中通氧氣或氮氣的方法來增加或減小氧飽和度，從而改變氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的濃度。 在液體模型中放入本文所用光源-探測器小距離散射光譜采集系統(tǒng)的探頭，采集模型的散射光譜后再按式(1)計算Δ[HbO]和Δ[Hb]。 同時，在模型中放入組織血氧儀探頭(ISS Oximeter)，以組織血氧儀的測量值作為檢驗式(1)準確度的金標準。 實驗在氧飽和度范圍為20%～90%的14個數(shù)值點進行測量(氧飽和度20%為基準)，重復實驗，使每個氧飽和度數(shù)值點都能獲得10次采樣。 兩種測量方法測得的Δ[HbO]和Δ[Hb]的比較如圖2所示。 式(1)中DPF取為常量20，其給出的計算結果與期望值誤差最小。 經(jīng)分析，式(1)計算值與標準值的相對誤差為14%±5%。

2 結果與討論

2.1 血流動力學參數(shù)相對變化

為了更好地顯示前扣帶回對福爾馬林誘導的傷害感受所作出的區(qū)域性血液動力學反應，圖3分別給出Δ[HbO]，Δ[Hb]和Δ[HbT]在注射前、后10 min的變化曲線(n=7，以平均值±標準偏差表示)。 圖上僅顯示小部分標準偏差線，以更好地顯示曲線。 圖中紅色箭頭處為注射的時間點。

圖3 前扣帶回血流動力學參數(shù)在注射前10 min和后10 min的變化(a)： 氧合血紅蛋白濃度變化； (b)： 脫氧血紅蛋白濃度變化； (c)： 總血紅蛋白濃度變化Fig.3 Changes of hemodynamic parameters of ACC in 10minutes before and 10 minutes after the injection(a)： Δ[HbO]; (b)： Δ[Hb]; (c)： Δ[HbT]

圖4所示為整個70 min內(nèi)區(qū)域血流動力學參數(shù)的變化曲線。 再按每5 min為一段的方式將數(shù)據(jù)按時間分組到13個時段，統(tǒng)計分析注射后每一時間段與注射前兩個時間段的差異，結果如圖5所示, 圖中#和∧表示該時間段的參數(shù)變化與注射前有顯著性差異(p=0.05)。

圖4 前扣帶回血流動力學參數(shù)注射前10 min和注射后60 min的變化Fig.4 Changes of hemodynamic parameters of ACC in 10minutes before and 60 minutes after the injection

圖5 每5 min時間段血流動力學參數(shù)變化差異性統(tǒng)計Fig.5 Statistics of the difference of hemodynamicparameters every 5 minutes

從圖3、圖4和圖5可知，隨著時間的推移，ACC區(qū)域的Δ[HbO]和Δ[Hb]均有顯著的變化。 具體而言，Δ[HbO]在注射后先是顯著增加，然后在10～20 min之間恢復到基線水平，之后為持續(xù)的單調(diào)下降。 反之，Δ[Hb]在注射后開始顯著下降，在注射后10～20 min之間恢復到基線水平，隨后持續(xù)單調(diào)增加。 與Δ[HbO]或Δ[Hb]不同，局部Δ[HbT]在注射后略增大，但沒有顯著性意義。

2.2 局部電信號功率變化

圖6為β波頻段(13～30 Hz)的功率強度與注射前10 min該頻段功率強度平均值的比值變化曲線(n=7，以平均值±標準偏差表示)。 再以5 min為時間段，統(tǒng)計分析注射后每一時間段與注射前兩個時間段的差異，結果如圖7所示，圖中*表示該時間段的功率比值與注射前有顯著性差異(p=0.05)。

圖6 局部電信號(13～30 Hz)功率比在注射前后的變化

圖7 β波每5 min時間段功率譜數(shù)據(jù)差異性統(tǒng)計

從圖6可知，注射福爾馬林前，β波段的功率比值較平穩(wěn)，變化范圍小。 注射福爾馬林后，功率比值呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，在注射后約20分鐘達到峰值，之后保持在峰值附近。 根據(jù)圖6與圖7，可以確認前扣帶回在疼痛傳導通路中產(chǎn)生響應，在注射后60 min內(nèi)都處于功能激活狀態(tài)。

2.3 討論

有研究表明，與人類視覺、體感和運動刺激相關的皮質(zhì)的血流動力學模式是[HbO]的增加伴隨著[Hb]的減少。 但當受試者執(zhí)行字謎任務時，在人類前額葉皮層中發(fā)現(xiàn)了一種相反的模式，即[HbO]減少伴隨著[Hb]的增加。 因此，腦功能的血流動力學模式與腦區(qū)和所執(zhí)行的任務相關。

根據(jù)ACC區(qū)域局部電信號功率變化曲線分析，注射福爾馬林后，ACC區(qū)域即被激活，且持續(xù)時間可達數(shù)小時。 ACC中的神經(jīng)元隨著被激活而氧需求增加。 局部血管通過一系列潛在的作用對其作出反應： 通過動脈血管擴張?zhí)峁└嗟腍bO，加快HbO的釋氧速度，將Hb轉(zhuǎn)移到小靜脈，并加速Hb的轉(zhuǎn)運。 因此，[HbO]增加，而[Hb]減少。 然而，福爾馬林誘導的氧氣需求持續(xù)數(shù)小時，局部血管將達到極限，無法進一步擴張，因此不能通過血管擴張和動脈血流入來維持[HbO]的增加。 [HbO]隨著神經(jīng)元持續(xù)的高耗氧而降低。 同時，局部血管的能力達到上限水平，不能有效地清除累積的血紅蛋白，導致[Hb]增加。 本研究結果顯示，在福爾馬林注射后的最初階段，區(qū)域[HbO]增加，同時[Hb]減少。 在注射后晚期，區(qū)域[HbO]減少，同時[Hb]增加。 這一結果與上述分析相吻合。

3 結 論

基于修正的Beer-Lambert定律，建立氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白濃度變化與光源-探測器小距離探頭所采集的散射光譜強度變化的關系式，計算結果經(jīng)驗證具有較高的準確性。 通過對大鼠后肢注懾福爾馬林溶液使大鼠產(chǎn)生疼痛刺激，利用光源-探測器小距離探頭獲得散射光譜，在此基礎上計算氧合血紅蛋白濃度、脫氧血紅蛋白濃度和總血紅蛋白濃度的相對變化，分析核團激活期間血流動力學的響應模式，同時，利用微電極采集腦局部放電信號，經(jīng)功率變化分析，確認大鼠前扣帶回區(qū)域血流動力學參數(shù)在注射后的變化與該區(qū)域功能激活高度相關。 以上結果表明，基于光源-探測器小距離探頭的局部散射光譜系統(tǒng)可有效地用于標記與疼痛處理相關的核團的功能激活和分析核團的神經(jīng)-血管耦合機制，為利用小動物模型增進對疼痛相關的腦血管功能的了解和疼痛測量提供了一種有效的新方式。