殷 明，王建林，黃浩亮，黃秋萍，楊萌萌，傅正平，陸亞林*

1. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)國家同步輻射實驗室，安徽 合肥 230026 2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心，安徽 合肥 230026 3. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230026

引 言

黃酮類化合物泛指兩個苯環(huán)通過中央三碳鏈連接而成的一類化合物，常以游離或糖苷形式廣泛存在于植物體內(nèi)的一大類多酚物質(zhì)，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤生長等藥理作用。 目前中草藥市場上以次充好、以假亂真的現(xiàn)象比較常見，嚴(yán)重擾亂市場秩序和消費(fèi)者身體健康，為了確保藥品質(zhì)量安全和保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，采用一種可靠、有效的中草藥檢測方法是必不可少的。 傳統(tǒng)的中草藥檢測方法包括光譜法[1]、色譜法[2-3]、質(zhì)譜法[4-5]等，但是每種方法各有優(yōu)劣，沒有一種方法可以解決所有問題。

太赫茲(Terahertz, THz)波是指頻率在0.1～10 THz范圍內(nèi)的電磁波，該頻段內(nèi)包含了大量有關(guān)物質(zhì)的物理、化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息以及多種分子振動模式，很多生物分子在太赫茲波段都有明顯的特征吸收峰，太赫茲譜學(xué)在食品、藥品、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值[6]。 本文利用太赫茲時域光譜技術(shù)(THz-TDS)研究常見的黃酮類化合物在太赫茲波段的光譜特性，同時利用幾種化學(xué)計量學(xué)方法對不同種類的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行種類鑒別和定量分析，為中草藥的檢測提供一種無損、快速、有效的分析方法，在中藥材市場檢測中具有重要的應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 設(shè)備

本文實驗裝置使用自搭的透射式THz-TDS系統(tǒng)，其原理圖如圖1所示。 通過測量得到太赫茲脈沖透過樣品和參考信號的振幅和相位信息，利用樣品信號[Es(ν)]和參考信號[Er(ν)]計算得到透射系數(shù)[T(ν)]，透射系數(shù)定義如式(1)

(1)

式(1)中，ν是頻率，d為樣品厚度，c為真空中的光速，a表示吸收系數(shù)，n表示折射率，根據(jù)式(1)中的實部和虛部，可以計算出樣品的折射率(n)和吸收系數(shù)(a)如式(2)和式(3)所示

(2)

(3)

圖1 透射式太赫茲時域光譜系統(tǒng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of transmission terahertztime-domain spectroscopy system

其中，w是角頻率，φ(ω)為相位差，ρ(ω)為幅值比，k(ω)表示消光系數(shù)。

1.2 樣品制備

研究了8種常見的黃酮類化合物，它們包括黃芩素、槲皮素、柚皮素、大豆素、黃芩苷、葛根素、染料木素和天麻素。 所有樣品純度均大于99%，并購買于同一批次，實驗前均放在恒溫恒濕箱中保存，未經(jīng)過其他預(yù)處理。 實驗樣品制備采用粉末壓片法，首先將樣品在瑪瑙研缽中充分研磨，然后與高密度聚乙烯粉末(HDPE)按照1∶2比例進(jìn)行充分混合，最后在壓片機(jī)下制成厚度為1 mm的薄片。 在做分類鑒別研究時，每種黃酮類物質(zhì)制備10個樣品，一共80個樣品作為待測樣品； 在做定量預(yù)測分析時，將黃酮類物質(zhì)與淀粉混合配制不同濃度的待測樣品，濃度范圍從10%～90%(w/w)(間隔10%)，每種濃度制備10個樣品，共90個樣品作為待測樣品。 在建立定性和定量模型時將每種黃酮類物質(zhì)按照比例隨機(jī)分成校正集(70%)和預(yù)測集(30%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜分析

實驗在室溫下利用THz-TDS測量了所有黃酮類化合物樣品，為了保證實驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，每個樣品測量3次取平均值得到樣品的太赫茲時域信號，原始時域信號經(jīng)過Savitsky-Golay濾波預(yù)處理后，再通過計算得到樣品在0.2～2.5 THz范圍內(nèi)的吸收系數(shù)，8種黃酮類物質(zhì)的THz吸收譜如圖2所示。 從圖中可以看出，雖然這些黃酮類物質(zhì)具有相似的分子結(jié)構(gòu)，但每種物質(zhì)在太赫茲波段都有明顯不同的特征吸收峰，體現(xiàn)了太赫茲對生物分子的指紋譜特性。 因此，可以通過太赫茲吸收譜對黃酮類物質(zhì)進(jìn)行種類鑒別。

圖2 8種黃酮類物質(zhì)的太赫茲吸收譜Fig.2 Terahertz absorption spectra of eight flavonoids

2.2 低溫分析

實驗測試了柚皮素和大豆素在78～320 K溫度范圍內(nèi)的的太赫茲吸收光譜，結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，隨著溫度的降低，柚皮素和大豆素的三個吸收峰逐漸增強(qiáng)，并且吸收峰頻率位置發(fā)生輕微的藍(lán)移，柚皮素的三個吸收峰1.4，1.58和1.78 THz分別藍(lán)移到1.42，1.6和1.80 THz，平移量為0.02 THz。 大豆素的三個吸收峰0.97，1.24和1.75 THz分別藍(lán)移到0.98，1.25和1.76 THz，平移量為0.01 THz。 通常，隨著溫度的降低，吸收峰變得更尖銳主要是能量振動態(tài)分布隨溫度變化的結(jié)果，而由溫度引起的吸收峰位置的頻移被認(rèn)為是多種機(jī)制作用的結(jié)果，其中，藍(lán)移主要是由于熱膨脹引起的鍵長增加以及振動勢的非諧性導(dǎo)致的，紅移主要是由于分子間弱相互作用力導(dǎo)致的[7-10]。

圖3 柚皮素和大豆素隨溫度變化的吸收譜Fig.3 Temperature dependent of absorption spectra of naringenin and daidzein

2.3 定性鑒別

主成分分析(principal component analysis, PCA)是一種基于統(tǒng)計學(xué)的無監(jiān)督模式識別方法，可以用來提取特征變量、降低數(shù)據(jù)維度以及可視化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。 支持向量機(jī)(support vector machines, SVM)是一種機(jī)器學(xué)習(xí)算法，具有很強(qiáng)的學(xué)習(xí)能力和泛化性能，可以有效地解決非線性的分類問題。 本文首先通過PCA方法對原始光譜數(shù)據(jù)提取特征變量，圖4所示為所有樣品吸收譜做主成分分析得到的三維得分圖，其中，前五個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率超過了98%，代表了原始數(shù)據(jù)的主要信息。 因此，可以提取前五個主成分作為SVM分類模型的輸入變量。 利用SVM在校正集上建立分類模型，選擇RBF徑向基核函數(shù)優(yōu)化模型，利用網(wǎng)格搜索尋找最優(yōu)參數(shù)，得到正則化參數(shù)c=0.735 6和核參數(shù)g=1.435 3，交叉驗證CV達(dá)到100%最高值，最后利用訓(xùn)練好的分類模型在預(yù)測集上對8種黃酮類物質(zhì)做分類鑒別，最終得到分類準(zhǔn)確率達(dá)到100%。 對比原始光譜數(shù)據(jù)作為支持向量機(jī)的輸入變量，本文利用PCA提取前五個主成分分量作為SVM輸入變量來建立校正模型，不僅提取了特征變量，而且減少了運(yùn)算量，提高了運(yùn)行效率和模型精確度。

圖4 8種黃酮類物質(zhì)太赫茲吸收譜的PCA三維得分圖Fig.4 PCA three-dimensional score map for terahertzabsorption spectra of eight flavonoids

2.4 定量分析

利用偏最小二乘回歸(partial least squares regression, PLSR)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network, ANN)回歸模型對淀粉中不同含量的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行定量分析，其中ANN模型采用RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。 在做定量預(yù)測分析過程中，通常用相關(guān)系數(shù)R2和均方根誤差RMSE兩個指標(biāo)來衡量模型的性能，其中，R2和RMSE的表達(dá)式如式(4)和式(5)所示

(4)

(5)

實驗測量得到了淀粉中不同濃度柚皮素和大豆素的太赫茲時域光譜如圖5(a)和(c)所示。 從圖中可以看出，隨著淀粉中黃酮類物質(zhì)濃度含量的增加，吸收峰強(qiáng)度也隨著增強(qiáng)。 利用兩種回歸方法對淀粉中黃酮類物質(zhì)的濃度建立了定量預(yù)測模型，其預(yù)測結(jié)果如圖5(b)和(d)所示，圖中顯示了淀粉中黃酮類物質(zhì)的真實濃度和預(yù)測濃度之間的關(guān)系。 對淀粉中不同濃度含量的柚皮素的定量分析中，利用PLSR回歸模型得到的預(yù)測結(jié)果為： 有效成分含量預(yù)測值與其真實值之間的相關(guān)系數(shù)R2=0.991 1，均方根誤差RMSE=2.428 8。 利用ANN回歸模型得到的預(yù)測結(jié)果為：R2=0.994 4，RMSE=1.932 5。 對淀粉中不同濃度含量的大豆素的定量分析中，利用PLSR回歸模型得到的預(yù)測結(jié)果為：R2=0.992 8，RMSE=2.188 5。 利用ANN回歸模型得到的預(yù)測結(jié)果為：R2=0.996 4，RMSE=1.544 1。 對比兩種模型預(yù)測結(jié)果可以看出，ANN模型具有更高的相關(guān)系數(shù)以及更低的均方根誤差，因此，結(jié)果證明了利用THz-TDS對淀粉中不同濃度含量的黃酮類化合物做定量分析時，ANN模型具有較高的預(yù)測精度。

3 結(jié) 論

利用THz-TDS研究了8種常見的黃酮類化合物在0.2～2.5 THz波段的生物分子特性，結(jié)果顯示均具有明顯不同的特征吸收峰，并研究了它們在78～320 K溫度范圍內(nèi)隨溫度變化的吸收特性，結(jié)果表明，隨著溫度的降低，特征吸收峰逐漸增強(qiáng)，主要是由能量振動態(tài)分布的影響，并且吸收峰位置發(fā)生藍(lán)移，主要是由于熱效應(yīng)以及振動勢的非諧性導(dǎo)致的。 另外，通過化學(xué)計量學(xué)方法對這些黃酮類化合物進(jìn)行種類鑒別和定量分析，首先利用PCA提取光譜特征變量，然后將前五個主成分分量作為SVM的輸入變量進(jìn)行分類鑒別，通過優(yōu)化模型得到最優(yōu)參數(shù)，得到分類準(zhǔn)確度為100%。 另外，采用PLSR和ANN回歸模型對淀粉中含有不同濃度的黃酮類物質(zhì)做定量檢測，結(jié)果ANN方法得到了最高的預(yù)測精度。 綜上所述，本文利用THz-TDS技術(shù)研究了黃酮類物質(zhì)在太赫茲波段的生物分子特性，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法為黃酮類物質(zhì)提供了一種快速、有效、無損的分類鑒別和定量分析方法，對中草藥的檢測和質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域具有實際的應(yīng)用價值。