樓喬明 李 哲 劉連亮 張進杰 楊文鴿 薛長湖

(1 寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800；2 中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

單甘酯(monoglyceride, MG), 又名單脂肪酸甘油酯, 其按結(jié)構(gòu)可分為1-單甘酯和2-單甘酯(圖1)。單甘酯分子中既存在疏水基團又存在親水基團, 是一種多元醇型非離子表面活性劑, 具有良好的乳化性、分散性、潤滑和增溶性, 因而廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[1-3]。同時, 生物中的脂質(zhì)組成復雜, 其中甘油酯、糖脂和磷脂等含有甘油骨架的脂質(zhì)成分能在相關(guān)酶的作用下水解生成單甘酯。

圖1 單甘酯的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Diagram of monoglyceride structure

目前，國內(nèi)外對單甘酯的分析方法主要有高碘酸氧化法、氣相色譜法、高效液相色譜和超高效合相色譜-質(zhì)譜法等[4-6]。高碘酸氧化法通過氧化1-單甘酯的鄰位羥基以測定單甘酯的含量，但該方法不能測定2-單甘酯的含量；同時此法操作復雜，消耗試劑多，且偏差相對較大[7]。正相高效液相色譜法對單甘酯上的脂肪酸、1-單甘酯和2-單甘酯的差異沒有選擇性，很難達到有效的色譜分離；而反相高效液相色譜法對溶劑要求較高，且梯度洗脫需要配置蒸發(fā)光散射檢測器[8]。氣相色譜法是分析單甘酯的常用方法，但其需要用標準品進行對照定性[9-10]。近年來，隨著衍生技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，在一定程度上彌補了氣相色譜技術(shù)的不足。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)對單甘酯的衍生方法和色譜條件進行優(yōu)化，并對單甘酯硅烷化衍生物的斷裂規(guī)律和質(zhì)譜特征進行分析，同時以從羅氏海盤車性腺分離到的單甘酯為樣品，對其組成進行分析檢測，以期為單甘酯的快速準確分析提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅氏海盤車(Asteriasrollestoni)，購自青島市南山水產(chǎn)市場；1-單軟脂酸甘油酯(1-C16：0-MG)和1-單硬脂酸甘油酯(1-C18：0-MG)，正丁基硼酸，阿拉丁試劑有限公司；2-單軟脂酸甘油酯(2-C16：0-MG)、2-單硬脂酸甘油酯(2-C18：0-MG)和乙酸酐，美國Sigma-Aldrich公司；硅烷化試劑(BSTFA∶TMCS，99∶1， m∶m)，美國Regis公司；薄層層析硅膠板GF254，青島海洋化工廠；正己烷、甲醇、三氯甲烷、丙酮和高氯酸等均為分析純，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

6890N型氣相色譜儀、5973型質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；Laborota 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國海道爾夫公司；DGG-9070AD型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；FA2104S型精密電子分析天平，上海楚定分析儀器有限公司；TGL-16G型高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 總脂提取 取10 g羅氏海盤車性腺樣品，加入200 mL三氯甲烷-甲醇(2∶1, v∶v)混合，超聲30 min，并浸提24 h，過濾，浸提液用40 mL 0.9%氯化鈉溶液洗滌，靜置分層，收集三氯甲烷層，并用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到羅氏海盤車的性腺總脂[11]。

1.3.2 單甘酯的分離制備 羅氏海盤車性腺總脂經(jīng)正己烷溶解，濕法裝柱上樣，正己烷-三氯甲烷梯度洗脫；收集洗脫液，進行硅膠板薄層層析(展開劑為正己烷∶乙醚∶乙酸=80∶19∶1，v∶v∶v)，碘蒸氣顯色，合并單甘酯部分的洗脫液，減壓干燥后用于后續(xù)衍生優(yōu)化和GC-MS分析。

1.3.3 單甘酯的衍生 硅烷化衍生：取2 mg單甘酯樣品，200 μL正己烷溶解后，加入200 μL硅烷化衍生試劑(BSTFA∶TMCS，99∶1 m∶m)，振蕩后于60℃反應30 min；反應結(jié)束后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于GC-MS分析。

乙?；苌喝? mg單甘酯樣品，加入200 μL乙酸酐于60℃反應30 min；反應結(jié)束后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于GC-MS分析。

異丙叉基化衍生：取2 mg單甘酯樣品，依次加入200 μL丙酮和20 μL高氯酸，并于60℃反應30 min，且反應過程中每隔10 min振蕩一次；反應結(jié)束后，加入過量碳酸鈉中和反應體系，并依次加入200 μL水和200 μL正己烷，振蕩混勻后，5 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)無水硫酸鈉干燥，用于GC-MS分析。

正丁基硼酸衍生：取2 mg單甘酯樣品，加入200 μL吡啶和50 mg正丁基硼酸，于60℃反應30 min，反應結(jié)束后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS分析 氣相條件：HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度230℃，檢測器溫度250℃；升溫程序：初始溫度180℃，以10℃·min-1升至280℃，保持15 min，整個分析過程25 min；高純氦氣為載氣，載氣流量1 mL·min-1；采用恒壓模式，壓力54 kPa，進樣量1.0 μL，分流比為25∶1。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度280℃，EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描周期2.84 次·s-1， 質(zhì)量掃描范圍m/z 50～600 u。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均進行3次重復，采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生方法的選擇

根據(jù)脂肪酸與甘油上羥基的結(jié)合位點，單甘酯可分為1-單甘酯和2-單甘酯，其甘油骨架上的二羥基結(jié)構(gòu)，表明單甘酯具有較強的極性和較低的揮發(fā)性，在常規(guī)氣相條件下難于分析，因此需要通過化學衍生方法提高單甘酯的揮發(fā)性，以便于后續(xù)的GC-MS分析[12-13]。

根據(jù)單甘酯結(jié)構(gòu)，相鄰或相間兩羥基的衍生方法主要有三甲基硅烷化法[14-15]、乙?；╗16-17]、異丙叉基化法[18]和正丁基硼酸法[19]等。本試驗采用上述4種方法對羅氏海盤車的單甘酯樣品進行衍生分析，結(jié)果顯示，三甲基硅烷化法共鑒定出8種單甘酯成分，乙?；ㄨb定出5種，而異丙叉基化法和正丁基硼酸法相對較少，分別僅鑒定出4種和2種。因此，本試驗采用三甲基硅烷化衍生法對單甘酯進行衍生，同時對衍生條件進行一定優(yōu)化，取得了理想的衍生效果。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

毛細管色譜柱和升溫程序是GC-MS分析的關(guān)鍵。HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，其固定相為5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷，具有較好的惰性、耐溫性(溫度上限325～350℃)和極低的柱流失等特性，能有效提高信噪比，具有更高的靈敏度，有助于獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜圖，是分析單甘酯硅烷化衍生物的理想色譜柱[20-21]。通過優(yōu)化升溫程序，即初始溫度180℃，以10℃·min-1升溫至280℃，并在280℃條件下保持15 min；在此色譜條件下，取得了理想的色譜分離效果。

2.3 質(zhì)譜特征分析

2.3.1 1-單甘酯的質(zhì)譜特征分析 1-單甘酯經(jīng)三甲基硅烷化衍生后，其硅烷化衍生物的斷裂方式見圖2。1-單甘酯硅烷化衍生物的甘油骨架上C2-C3鍵斷裂，產(chǎn)生碎片離子[CH2-O-Si(CH3)3]+(m/z 103)和[M-103]+，且離子[M-103]+為1-單甘酯硅烷化衍生物的基峰離子；而甘油骨架上C1-C2鍵斷裂，產(chǎn)生離子[(CH3)3Si-O-CH=CH2-O-Si(CH3)3]+(m/z 205)；同時，1-單甘酯硅烷化衍生物中的硅氧鍵斷裂形成三甲基硅烷基離子[(CH3)3Si-]+(m/z 73)和[M-73]+，且離子m/z 73、m/z 205與基峰離子[M-103]+可作為判斷1-單甘酯硅烷化衍生物的重要依據(jù)[22-23]。在1-單甘酯硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖中未見分子離子M+，但衍生物中三甲基硅烷基上的甲基斷裂產(chǎn)生的離子[M-15]+可作為判斷其分子量的重要依據(jù)[24]。由此可以得到1-單甘酯硅烷化衍生物的特征離子為m/z 73、m/z 205、[M-103]+(基峰離子)和[M-15]+。

圖3 1-單軟脂酸甘油酯三甲基硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of trimethylsilyl derivative of 1-monopalmitin

以1-單軟脂酸甘油酯(1-C16∶0-MG)為例，其硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖見圖3，可以看出基峰離子m/z 371為離子[M-103]+，同時結(jié)合具有較強離子強度的m/z 73和m/z 205，表明其為1-單甘酯硅烷化衍生物；且離子[M-103]+和[M-15]+依次為m/z 371和m/z 459，表明其分子量為474，是1-單軟脂酸甘油酯硅烷化衍生物。因此1-單甘酯經(jīng)硅烷化衍生，采用GC-MS法，通過質(zhì)譜特征離子能快速有效地對1-單甘酯進行分析鑒定。

圖2 1-單甘酯三甲基硅烷化衍生物的斷裂方式Fig.2 Fracture mode of trimethylsilyl derivative of 1-monoglyceride

2.3.2 2-單甘酯的質(zhì)譜特征分析 2-單甘酯經(jīng)三甲基硅烷化衍生后，其硅烷化衍生物的斷裂方式見圖4。2-單甘酯硅烷化衍生物中硅氧鍵斷裂形成三甲基硅烷基離子[(CH3)3Si-]+(m/z 73)，此離子為2-單甘酯硅烷化衍生物的基峰離子；甘油骨架C2處的酰氧基斷裂生成離子[(CH3)3Si-O-CH-CH=CH2-O-Si(CH3)3]+(m/z 218)，且在此離子基礎(chǔ)上進一步斷裂失去一個三甲基硅烷氧基[(CH3)3Si-O-]，生成離子[(CH3)3Si-O-CH-CH=CH2]+(m/z 129)；同時母離子斷裂失去三甲基硅烷基[(CH3)3Si-]+和三甲基硅烷氧基[(CH3)3Si-O-]+產(chǎn)生離子[M+H-162]+，在2-單甘酯硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖中離子m/z 73、m/z 129、m/z 218和[M+H-162]+的離子強度顯著高于1-單甘酯衍生物質(zhì)譜圖中的相應離子(P<0.05)，因此可作為判斷2-單甘酯硅烷化衍生物的重要依據(jù)[24]。在2-單甘酯硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖中未見分子離子M+，但衍生物中三甲基硅烷基上的甲基斷裂產(chǎn)生的離子[M-15]+可作為判斷其分子量的重要依據(jù)[24]。由此可以得到2-單甘酯硅烷化衍生物的特征離子為m/z 73(基峰離子)、m/z 129、m/z 218、[M+H-162]+和[M-15]+。

以2-單軟脂酸甘油酯(2-C16：0-MG)為例，其硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖見圖5，可以看出基峰離子m/z 73，且離子m/z 129、m/z 218和m/z 313具有較強離子強度表明其為2-單甘酯硅烷化衍生物；且離子[M+H-162]+和[M-15]+依次為m/z 313和m/z 459，表明其分子量是474，為2-單軟脂酸甘油酯硅烷化衍生物。因此2-單甘酯經(jīng)硅烷化衍生，采用GC-MS法，通過質(zhì)譜特征離子能快速有效地對2-單甘酯進行分析鑒定。

圖4 2-單甘酯三甲基硅烷化衍生物的斷裂方式Fig.4 Fracture mode of trimethylsilyl derivative of 2-monoglyceride

圖5 2-單軟脂酸甘酯三甲基硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of trimethylsilyl derivative of 2-monopalmitin

2.4 單甘酯組成分析

羅氏海盤車性腺總脂中的單甘酯經(jīng)硅膠柱分離純化和三甲基硅烷化衍生，通過GC-MS分析，其總離子流色譜圖見圖6；通過質(zhì)譜特征離子，并結(jié)合標準品和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行定性分析，同時按峰面積歸一法進行定量，其結(jié)果見表1。

從總離子流色譜圖中可以看出，單甘酯硅烷化衍生物在HP-5MS毛細管柱中的色譜保留時間具有一定的規(guī)律：不同碳數(shù)單甘酯的硅烷化衍生物，碳數(shù)小的先出峰，碳數(shù)大的后出峰；相同碳數(shù)單甘酯的硅烷化衍生物，2-單甘酯先出峰，1-單甘酯后出峰。同時，從羅氏海盤車性腺總脂中共鑒定出8種單甘酯，以1-單甘酯為主，其中1-單軟脂酸甘油酯(1-C16：0-MG)含量最高，占單甘酯總含量的69.28%；1-單硬脂酸甘油酯(1-C18：0-MG)次之，含量為19.83%；而2-單甘酯含量相對較低，其總含量僅為7.01%。

圖6 羅氏海盤車中單甘酯衍生物的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of monoglyceride derivatives of Asterias rollestoni

表1 羅氏海盤車中單甘酯的組成和含量Table 1 Monoglyceride compositions and contents of Asterias rollestoni

3 討論

硅烷化試劑(BSTFA∶TMCS，99∶1 m∶m)能對單甘酯上相鄰或相間兩羥基進行快速硅烷化衍生，-Si(CH3)3取代單甘酯中羥基上的活性氫原子，增強衍生產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性，能有效改善色譜峰形，提高色譜分離度和檢測靈敏度，降低檢出限[25]；同時，1-單甘酯和2-單甘酯異構(gòu)體硅烷化衍生物差異明顯，有助于兩者衍生物的色譜分離；且2種單甘酯硅烷化衍生物的斷裂規(guī)律特征明確，結(jié)構(gòu)特征離子碎片豐富且差異明顯，便于質(zhì)譜分析鑒定[26]。而乙酰化法、異丙叉基化法和正丁基硼酸法對單甘酯羥基的衍生效果相對較差，所得單甘酯衍生物種類少，且衍生物的色譜峰形和檢測靈敏度均不理想，不利于單甘酯衍生物的氣相分離和質(zhì)譜分析判斷。

硅烷化試劑的反應性能較強，如毛細管柱的極性較大，易使衍生試劑與毛細管柱中的固定相發(fā)生反應，進而影響毛細管柱的分離效果；同時，盡管單甘酯通過硅烷化衍生使衍生物的揮發(fā)性增強，但總體上硅烷化衍生物的揮發(fā)性能相對較弱，致使氣相分析過程中溫度較高，這就要求毛細管柱具備較高的熱穩(wěn)定性。HP-5MS毛細管色譜柱的耐溫性能好，溫度上限325～350℃，且具有較好的惰性和極低的柱流失，能滿足單甘酯的氣相色譜分離和質(zhì)譜分析[27]。

采用硅膠柱層析對羅氏海盤車性腺單甘酯進行分離制備，對分離到的純度較高的單甘酯組分進行收集濃縮，并經(jīng)三甲基硅烷化衍生和氣相色譜-質(zhì)譜分析，共鑒定出8種單甘酯，且以1-單軟脂酸甘油酯(1-C16：0-MG)和1-單硬脂酸甘油酯(1-C18：0-MG)為主。羅氏海盤車性腺脂肪酸組成復雜，以C14：0、C16：0、C18：0、C18：1n-7、C20：1n-11和C20：5n-3為主[28]，因此要對羅氏海盤車性腺的單甘酯組成進行綜合全面分析還需對單甘酯分離純化工藝進行優(yōu)化。

4 結(jié)論

三甲基硅烷化法對單甘酯的衍生效果優(yōu)于乙酰化法、異丙叉基化法和正丁基硼酸法。弱極性毛細管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)適用于單甘酯硅烷化衍生物的氣相分析，通過優(yōu)化色譜升溫程序，取得了理想的分離效果。單甘酯硅烷化衍生物的斷裂規(guī)律明確，結(jié)構(gòu)特征離子碎片豐富，易于分析鑒別；且其色譜保留時間具有一定的規(guī)律性。從羅氏海盤車性腺中共鑒定出8種單甘酯，以1-單軟脂酸甘油酯和1-單硬脂酸甘油脂等1-單甘酯為主，而2-單甘酯含量相對較低。本研究結(jié)果為單甘酯的衍生、色譜分析和質(zhì)譜鑒定提供了一定的理論參考。