樓喬明 李 哲 劉連亮 張進(jìn)杰 楊文鴿 薛長湖

(1 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800；2 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

單甘酯(monoglyceride, MG), 又名單脂肪酸甘油酯, 其按結(jié)構(gòu)可分為1-單甘酯和2-單甘酯(圖1)。單甘酯分子中既存在疏水基團(tuán)又存在親水基團(tuán), 是一種多元醇型非離子表面活性劑, 具有良好的乳化性、分散性、潤滑和增溶性, 因而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[1-3]。同時(shí), 生物中的脂質(zhì)組成復(fù)雜, 其中甘油酯、糖脂和磷脂等含有甘油骨架的脂質(zhì)成分能在相關(guān)酶的作用下水解生成單甘酯。

圖1 單甘酯的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Diagram of monoglyceride structure

目前，國內(nèi)外對(duì)單甘酯的分析方法主要有高碘酸氧化法、氣相色譜法、高效液相色譜和超高效合相色譜-質(zhì)譜法等[4-6]。高碘酸氧化法通過氧化1-單甘酯的鄰位羥基以測(cè)定單甘酯的含量，但該方法不能測(cè)定2-單甘酯的含量；同時(shí)此法操作復(fù)雜，消耗試劑多，且偏差相對(duì)較大[7]。正相高效液相色譜法對(duì)單甘酯上的脂肪酸、1-單甘酯和2-單甘酯的差異沒有選擇性，很難達(dá)到有效的色譜分離；而反相高效液相色譜法對(duì)溶劑要求較高，且梯度洗脫需要配置蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[8]。氣相色譜法是分析單甘酯的常用方法，但其需要用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照定性[9-10]。近年來，隨著衍生技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，在一定程度上彌補(bǔ)了氣相色譜技術(shù)的不足。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)對(duì)單甘酯的衍生方法和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)單甘酯硅烷化衍生物的斷裂規(guī)律和質(zhì)譜特征進(jìn)行分析，同時(shí)以從羅氏海盤車性腺分離到的單甘酯為樣品，對(duì)其組成進(jìn)行分析檢測(cè)，以期為單甘酯的快速準(zhǔn)確分析提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅氏海盤車(Asteriasrollestoni)，購自青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng)；1-單軟脂酸甘油酯(1-C16：0-MG)和1-單硬脂酸甘油酯(1-C18：0-MG)，正丁基硼酸，阿拉丁試劑有限公司；2-單軟脂酸甘油酯(2-C16：0-MG)、2-單硬脂酸甘油酯(2-C18：0-MG)和乙酸酐，美國Sigma-Aldrich公司；硅烷化試劑(BSTFA∶TMCS，99∶1， m∶m)，美國Regis公司；薄層層析硅膠板GF254，青島海洋化工廠；正己烷、甲醇、三氯甲烷、丙酮和高氯酸等均為分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N型氣相色譜儀、5973型質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；Laborota 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國海道爾夫公司；DGG-9070AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2104S型精密電子分析天平，上海楚定分析儀器有限公司；TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總脂提取 取10 g羅氏海盤車性腺樣品，加入200 mL三氯甲烷-甲醇(2∶1, v∶v)混合，超聲30 min，并浸提24 h，過濾，浸提液用40 mL 0.9%氯化鈉溶液洗滌，靜置分層，收集三氯甲烷層，并用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到羅氏海盤車的性腺總脂[11]。

1.3.2 單甘酯的分離制備 羅氏海盤車性腺總脂經(jīng)正己烷溶解，濕法裝柱上樣，正己烷-三氯甲烷梯度洗脫；收集洗脫液，進(jìn)行硅膠板薄層層析(展開劑為正己烷∶乙醚∶乙酸=80∶19∶1，v∶v∶v)，碘蒸氣顯色，合并單甘酯部分的洗脫液，減壓干燥后用于后續(xù)衍生優(yōu)化和GC-MS分析。

1.3.3 單甘酯的衍生 硅烷化衍生：取2 mg單甘酯樣品，200 μL正己烷溶解后，加入200 μL硅烷化衍生試劑(BSTFA∶TMCS，99∶1 m∶m)，振蕩后于60℃反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于GC-MS分析。

乙酰化衍生：取2 mg單甘酯樣品，加入200 μL乙酸酐于60℃反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于GC-MS分析。

異丙叉基化衍生：取2 mg單甘酯樣品，依次加入200 μL丙酮和20 μL高氯酸，并于60℃反應(yīng)30 min，且反應(yīng)過程中每隔10 min振蕩一次；反應(yīng)結(jié)束后，加入過量碳酸鈉中和反應(yīng)體系，并依次加入200 μL水和200 μL正己烷，振蕩混勻后，5 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)無水硫酸鈉干燥，用于GC-MS分析。

正丁基硼酸衍生：取2 mg單甘酯樣品，加入200 μL吡啶和50 mg正丁基硼酸，于60℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS分析 氣相條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度230℃，檢測(cè)器溫度250℃；升溫程序：初始溫度180℃，以10℃·min-1升至280℃，保持15 min，整個(gè)分析過程25 min；高純氦氣為載氣，載氣流量1 mL·min-1；采用恒壓模式，壓力54 kPa，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比為25∶1。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度280℃，EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描周期2.84 次·s-1， 質(zhì)量掃描范圍m/z 50～600 u。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生方法的選擇

根據(jù)脂肪酸與甘油上羥基的結(jié)合位點(diǎn)，單甘酯可分為1-單甘酯和2-單甘酯，其甘油骨架上的二羥基結(jié)構(gòu)，表明單甘酯具有較強(qiáng)的極性和較低的揮發(fā)性，在常規(guī)氣相條件下難于分析，因此需要通過化學(xué)衍生方法提高單甘酯的揮發(fā)性，以便于后續(xù)的GC-MS分析[12-13]。

根據(jù)單甘酯結(jié)構(gòu)，相鄰或相間兩羥基的衍生方法主要有三甲基硅烷化法[14-15]、乙?；╗16-17]、異丙叉基化法[18]和正丁基硼酸法[19]等。本試驗(yàn)采用上述4種方法對(duì)羅氏海盤車的單甘酯樣品進(jìn)行衍生分析，結(jié)果顯示，三甲基硅烷化法共鑒定出8種單甘酯成分，乙酰化法鑒定出5種，而異丙叉基化法和正丁基硼酸法相對(duì)較少，分別僅鑒定出4種和2種。因此，本試驗(yàn)采用三甲基硅烷化衍生法對(duì)單甘酯進(jìn)行衍生，同時(shí)對(duì)衍生條件進(jìn)行一定優(yōu)化，取得了理想的衍生效果。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

毛細(xì)管色譜柱和升溫程序是GC-MS分析的關(guān)鍵。HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，其固定相為5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷，具有較好的惰性、耐溫性(溫度上限325～350℃)和極低的柱流失等特性，能有效提高信噪比，具有更高的靈敏度，有助于獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜圖，是分析單甘酯硅烷化衍生物的理想色譜柱[20-21]。通過優(yōu)化升溫程序，即初始溫度180℃，以10℃·min-1升溫至280℃，并在280℃條件下保持15 min；在此色譜條件下，取得了理想的色譜分離效果。

2.3 質(zhì)譜特征分析

2.3.1 1-單甘酯的質(zhì)譜特征分析 1-單甘酯經(jīng)三甲基硅烷化衍生后，其硅烷化衍生物的斷裂方式見圖2。1-單甘酯硅烷化衍生物的甘油骨架上C2-C3鍵斷裂，產(chǎn)生碎片離子[CH2-O-Si(CH3)3]+(m/z 103)和[M-103]+，且離子[M-103]+為1-單甘酯硅烷化衍生物的基峰離子；而甘油骨架上C1-C2鍵斷裂，產(chǎn)生離子[(CH3)3Si-O-CH=CH2-O-Si(CH3)3]+(m/z 205)；同時(shí)，1-單甘酯硅烷化衍生物中的硅氧鍵斷裂形成三甲基硅烷基離子[(CH3)3Si-]+(m/z 73)和[M-73]+，且離子m/z 73、m/z 205與基峰離子[M-103]+可作為判斷1-單甘酯硅烷化衍生物的重要依據(jù)[22-23]。在1-單甘酯硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖中未見分子離子M+，但衍生物中三甲基硅烷基上的甲基斷裂產(chǎn)生的離子[M-15]+可作為判斷其分子量的重要依據(jù)[24]。由此可以得到1-單甘酯硅烷化衍生物的特征離子為m/z 73、m/z 205、[M-103]+(基峰離子)和[M-15]+。

圖3 1-單軟脂酸甘油酯三甲基硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of trimethylsilyl derivative of 1-monopalmitin

以1-單軟脂酸甘油酯(1-C16∶0-MG)為例，其硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖見圖3，可以看出基峰離子m/z 371為離子[M-103]+，同時(shí)結(jié)合具有較強(qiáng)離子強(qiáng)度的m/z 73和m/z 205，表明其為1-單甘酯硅烷化衍生物；且離子[M-103]+和[M-15]+依次為m/z 371和m/z 459，表明其分子量為474，是1-單軟脂酸甘油酯硅烷化衍生物。因此1-單甘酯經(jīng)硅烷化衍生，采用GC-MS法，通過質(zhì)譜特征離子能快速有效地對(duì)1-單甘酯進(jìn)行分析鑒定。

圖2 1-單甘酯三甲基硅烷化衍生物的斷裂方式Fig.2 Fracture mode of trimethylsilyl derivative of 1-monoglyceride

2.3.2 2-單甘酯的質(zhì)譜特征分析 2-單甘酯經(jīng)三甲基硅烷化衍生后，其硅烷化衍生物的斷裂方式見圖4。2-單甘酯硅烷化衍生物中硅氧鍵斷裂形成三甲基硅烷基離子[(CH3)3Si-]+(m/z 73)，此離子為2-單甘酯硅烷化衍生物的基峰離子；甘油骨架C2處的酰氧基斷裂生成離子[(CH3)3Si-O-CH-CH=CH2-O-Si(CH3)3]+(m/z 218)，且在此離子基礎(chǔ)上進(jìn)一步斷裂失去一個(gè)三甲基硅烷氧基[(CH3)3Si-O-]，生成離子[(CH3)3Si-O-CH-CH=CH2]+(m/z 129)；同時(shí)母離子斷裂失去三甲基硅烷基[(CH3)3Si-]+和三甲基硅烷氧基[(CH3)3Si-O-]+產(chǎn)生離子[M+H-162]+，在2-單甘酯硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖中離子m/z 73、m/z 129、m/z 218和[M+H-162]+的離子強(qiáng)度顯著高于1-單甘酯衍生物質(zhì)譜圖中的相應(yīng)離子(P<0.05)，因此可作為判斷2-單甘酯硅烷化衍生物的重要依據(jù)[24]。在2-單甘酯硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖中未見分子離子M+，但衍生物中三甲基硅烷基上的甲基斷裂產(chǎn)生的離子[M-15]+可作為判斷其分子量的重要依據(jù)[24]。由此可以得到2-單甘酯硅烷化衍生物的特征離子為m/z 73(基峰離子)、m/z 129、m/z 218、[M+H-162]+和[M-15]+。

以2-單軟脂酸甘油酯(2-C16：0-MG)為例，其硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖見圖5，可以看出基峰離子m/z 73，且離子m/z 129、m/z 218和m/z 313具有較強(qiáng)離子強(qiáng)度表明其為2-單甘酯硅烷化衍生物；且離子[M+H-162]+和[M-15]+依次為m/z 313和m/z 459，表明其分子量是474，為2-單軟脂酸甘油酯硅烷化衍生物。因此2-單甘酯經(jīng)硅烷化衍生，采用GC-MS法，通過質(zhì)譜特征離子能快速有效地對(duì)2-單甘酯進(jìn)行分析鑒定。

圖4 2-單甘酯三甲基硅烷化衍生物的斷裂方式Fig.4 Fracture mode of trimethylsilyl derivative of 2-monoglyceride

圖5 2-單軟脂酸甘酯三甲基硅烷化衍生物的質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of trimethylsilyl derivative of 2-monopalmitin

2.4 單甘酯組成分析

羅氏海盤車性腺總脂中的單甘酯經(jīng)硅膠柱分離純化和三甲基硅烷化衍生，通過GC-MS分析，其總離子流色譜圖見圖6；通過質(zhì)譜特征離子，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析，同時(shí)按峰面積歸一法進(jìn)行定量，其結(jié)果見表1。

從總離子流色譜圖中可以看出，單甘酯硅烷化衍生物在HP-5MS毛細(xì)管柱中的色譜保留時(shí)間具有一定的規(guī)律：不同碳數(shù)單甘酯的硅烷化衍生物，碳數(shù)小的先出峰，碳數(shù)大的后出峰；相同碳數(shù)單甘酯的硅烷化衍生物，2-單甘酯先出峰，1-單甘酯后出峰。同時(shí)，從羅氏海盤車性腺總脂中共鑒定出8種單甘酯，以1-單甘酯為主，其中1-單軟脂酸甘油酯(1-C16：0-MG)含量最高，占單甘酯總含量的69.28%；1-單硬脂酸甘油酯(1-C18：0-MG)次之，含量為19.83%；而2-單甘酯含量相對(duì)較低，其總含量僅為7.01%。

圖6 羅氏海盤車中單甘酯衍生物的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of monoglyceride derivatives of Asterias rollestoni

表1 羅氏海盤車中單甘酯的組成和含量Table 1 Monoglyceride compositions and contents of Asterias rollestoni

3 討論

硅烷化試劑(BSTFA∶TMCS，99∶1 m∶m)能對(duì)單甘酯上相鄰或相間兩羥基進(jìn)行快速硅烷化衍生，-Si(CH3)3取代單甘酯中羥基上的活性氫原子，增強(qiáng)衍生產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性，能有效改善色譜峰形，提高色譜分離度和檢測(cè)靈敏度，降低檢出限[25]；同時(shí)，1-單甘酯和2-單甘酯異構(gòu)體硅烷化衍生物差異明顯，有助于兩者衍生物的色譜分離；且2種單甘酯硅烷化衍生物的斷裂規(guī)律特征明確，結(jié)構(gòu)特征離子碎片豐富且差異明顯，便于質(zhì)譜分析鑒定[26]。而乙酰化法、異丙叉基化法和正丁基硼酸法對(duì)單甘酯羥基的衍生效果相對(duì)較差，所得單甘酯衍生物種類少，且衍生物的色譜峰形和檢測(cè)靈敏度均不理想，不利于單甘酯衍生物的氣相分離和質(zhì)譜分析判斷。

硅烷化試劑的反應(yīng)性能較強(qiáng)，如毛細(xì)管柱的極性較大，易使衍生試劑與毛細(xì)管柱中的固定相發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而影響毛細(xì)管柱的分離效果；同時(shí)，盡管單甘酯通過硅烷化衍生使衍生物的揮發(fā)性增強(qiáng)，但總體上硅烷化衍生物的揮發(fā)性能相對(duì)較弱，致使氣相分析過程中溫度較高，這就要求毛細(xì)管柱具備較高的熱穩(wěn)定性。HP-5MS毛細(xì)管色譜柱的耐溫性能好，溫度上限325～350℃，且具有較好的惰性和極低的柱流失，能滿足單甘酯的氣相色譜分離和質(zhì)譜分析[27]。

采用硅膠柱層析對(duì)羅氏海盤車性腺單甘酯進(jìn)行分離制備，對(duì)分離到的純度較高的單甘酯組分進(jìn)行收集濃縮，并經(jīng)三甲基硅烷化衍生和氣相色譜-質(zhì)譜分析，共鑒定出8種單甘酯，且以1-單軟脂酸甘油酯(1-C16：0-MG)和1-單硬脂酸甘油酯(1-C18：0-MG)為主。羅氏海盤車性腺脂肪酸組成復(fù)雜，以C14：0、C16：0、C18：0、C18：1n-7、C20：1n-11和C20：5n-3為主[28]，因此要對(duì)羅氏海盤車性腺的單甘酯組成進(jìn)行綜合全面分析還需對(duì)單甘酯分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化。

4 結(jié)論

三甲基硅烷化法對(duì)單甘酯的衍生效果優(yōu)于乙?；?、異丙叉基化法和正丁基硼酸法。弱極性毛細(xì)管柱HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)適用于單甘酯硅烷化衍生物的氣相分析，通過優(yōu)化色譜升溫程序，取得了理想的分離效果。單甘酯硅烷化衍生物的斷裂規(guī)律明確，結(jié)構(gòu)特征離子碎片豐富，易于分析鑒別；且其色譜保留時(shí)間具有一定的規(guī)律性。從羅氏海盤車性腺中共鑒定出8種單甘酯，以1-單軟脂酸甘油酯和1-單硬脂酸甘油脂等1-單甘酯為主，而2-單甘酯含量相對(duì)較低。本研究結(jié)果為單甘酯的衍生、色譜分析和質(zhì)譜鑒定提供了一定的理論參考。