王 澤，郭志祥，葛圣林

心房纖顫(atrial fibrillation, AF)是目前最常見的心律不齊之一，AF發(fā)作會造成血流動力學改變，極易引起血栓的形成。所以AF是引發(fā)中風、心力衰竭和死亡的重要危險因素。由于AF對醫(yī)療系統(tǒng)帶來的負擔持續(xù)上升，因此臨床醫(yī)師準確鑒別出高風險的AF患者并及時采取預防和治療手段已變得至關重要?；罨疶細胞因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)是一種受Ca2+調節(jié)以控制基因表達的轉錄因子家族。越來越多的數據表明鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)/ NFAT信號通路在心臟肥大和纖維化中起重要作用[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding ribonucleic acid , LncRNA)是一組非蛋白質編碼的RNA分子，長度大于200個核苷酸。現國外尚未有研究結果證實NRON對于NFAT的具體作用機制，該研究探討LncRNA NRON影響NFAT的具體機制及其對心肌纖維化進程的影響，從而為臨床預測和治療AF提供了新的可行性。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2018～2019年安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科包括心臟瓣膜置換術在內的34例AF患者(AF組)和20例竇性心律(sinus rhythm, SR)患者(SR組)。排除標準如下：服用抗心律失常藥物(β受體阻滯劑除外)的AF患者或有其他心律不齊病史的患者；植入永久起搏器的患者；既往或計劃進行Cox迷宮手術的患者；中重度二尖瓣疾病患者；有二尖瓣置換術手術史患者；先天性心臟畸形患者；急診手術患者；全身性炎癥或癌癥患者；人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染或營養(yǎng)不良患者。在收集入組患者組織樣本時，所有患者未接受過皮質類固醇或非類固醇抗炎藥治療。本研究得到安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院人類倫理委員會的批準，嚴格遵守《赫爾辛斯基宣言》實施試驗，并獲得了所有入組患者或其直系家屬的書面知情同意。

1.2 主要試劑胎牛血清(上海斯信生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國R&D Systems公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)； troponin IF一抗、vimentin IF一抗(美國Cell Signaling Technology公司)；IF二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；vimentin免疫印跡一抗、troponin免疫印跡一抗(武漢莫納生物科技有限公司)，GAPDH免疫印跡一抗、免疫印跡二抗(上海斯信生物科技有限公司)，引物(美國Thermo Fisher Scientific公司)；熒光定量 PCR 試劑盒(日本Takara公司)；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純化。

1.3 主要方法

1.3.1細胞分離、培養(yǎng)和轉染 術中從SR患者中取出心臟組織，并在PBS培養(yǎng)基中洗滌。膠原酶和蛋白酶消化后，將原發(fā)性心房成纖維細胞進行原代培養(yǎng)。3次傳代后，收集細胞，更換培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。之后將pcDNA-NRON和si-NRON轉染至原代心房成纖維細胞。培養(yǎng)48 h后，收集細胞用于進一步實驗。

1.3.2qRT-PCR 提取總RNA。對High Capacity cDNA進行逆轉錄。然后在PCR檢測儀上進行qRT-PCR反應，選擇GAPDH作為內參。 數據是針對每個cDNA標準化為參考基因GAPDH樣品。本研究中使用的引物序列包括： NRON forward:5′-AC GTTCCTTAATGTACGCCTTTGC-3′，reverse: 5′-TTGG CCGTGTCCTGAGTCCTT-3′；Collagen Ⅰ forward：5′-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3′，reverse：5′-CCACGT CTCACCATTGGGG-3′；Collagen Ⅲ forward：5′-TTTTG CAGTGATATGTGATGTT-3′，reverse：5′-GGATGGTGG TTTTCAGTTTA-3′。

1.3.3免疫組織化學 將組織分離物制成4 μm石蠟切片，然后進行脫蠟并通過分級乙醇水化。 孵育切片并用PBS沖洗后進行抗原恢復。然后加入膠原蛋白Ⅰ一抗(1 ∶200)，在4 ℃下孵育過夜并用PBS沖洗，然后添加第二種抗體在37 ℃下孵育2 h并用PBS沖洗。染色后用水洗滌。將它們在梯度乙醇系列和二甲苯中脫水，然后覆蓋。最后用顯微鏡觀察免疫組織化學結果。

1.3.4Western blot 使用RIPA裂解緩沖液從成纖維細胞中提取總蛋白，并用BCA套件進行定量檢測。將等體積的蛋白質進行SDS-PAGE，經過轉膜、封閉、洗膜, 孵育一抗 (1 ∶500) , 4 ℃搖床過夜。二抗 (1 ∶5 000) 孵育, 洗膜, ECL發(fā)光法顯影。

1.3.5免疫熒光染色 首先用PBS處理成纖維細胞，在室溫下用0.5%Triton X-100處理20 min，再沖洗3次，1%BSA封閉過夜，波形蛋白抗體(1 ∶100)和肌鈣蛋白抗體(1 ∶100)在4 ℃孵育過夜，用PBS沖洗3次，每次2 min。將制劑在37 ℃下溫育30 min，然后將PBS漂洗3次,將DAPI ∶緩沖液按1 ∶1 000配置DAPI工作液，在每張玻璃片上都滴加DAPI工作液，室溫下避光孵育5 min，對細胞爬片進行核染，然后使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3.6CCK-8增殖實驗 常規(guī)消化與不同來源的成纖維細胞，接種于96孔板，每孔3 000個細胞，CCK-8法檢測轉染pcDNA-NRON和si-NRON后的成纖維細胞增殖能力，使用未參與轉染的成纖維細胞作為對照。將對數生長期細胞用胰蛋白酶消化，配制成細胞懸液接種于96孔板，每組的樣本設5個重復，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待檢測前每孔中加入10 μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。使用酶標儀測定450 nm吸光度值，以溶劑處理的細胞為對照組，不含細胞的培養(yǎng)基為空白組，按公式計算細胞的增殖率。細胞增殖率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.3.7HE染色和Masson染色 收集入組樣本組織并固定在4%中性多聚甲醛中，進行石蠟包埋。常規(guī)使用蘇木精/伊紅(HE)染色以進行組織學檢查。同時，使用Masson三色染色法，對心房組織內的纖維組織進行定位。使用Image-Pro plus分析系統(tǒng)對纖維化進行半定量評估。

1.3.8動物實驗 將小鼠隨機分為4組，每組6只：正常對照組(control組)、血管緊張素Ⅱ誘導的纖維化組(Ang-Ⅱ組)、 Ang-Ⅱ+pcDNA組和Ang-Ⅱ+ pcDNA-NRON組。經腹膜注射Ang-Ⅱ 1.5 μg/g/d，持續(xù)4周，同時對Ang-Ⅱ+pcDNA組和Ang-Ⅱ+pcDNA-NRON組小鼠經尾靜脈注射pcDNA和pcDNA-NRON。2周后，將小鼠麻醉并取出心臟組織進行進一步分析。所有動物實驗均得到安徽醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準。

2 結果

2.1 AF患者心房組織中LncRNA NRON的表達和心房纖維化蛋白的表達為了研究lncRNA NRON在AF患者中的表達，收集了AF組和SR組患者的心房組織。與SR患者比較，AF的心房組織中NRON表達明顯降低，見圖1A。根據紐約心臟協會(NYHA)制定標準，將34例AF患者分為不同的病理等級(Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)(圖1B)。AF患者心房組織中NRON的mRNA水平顯著降低。檢測心房纖維化相關蛋白的表達，AF心房中膠原Ⅰ和膠原Ⅲ表達水平明顯上調(圖1C～E)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫組織化學結果顯示AF心房組織中膠原Ⅰ在心肌間質、血管內皮細胞和血管基底膜中的表達和分布比SR心房組織中更廣泛(圖1F)。

2.2 LncRNA NRON過表達對心房纖維化的影響從SR患者的心房組織中分離出了心房成纖維細胞，并在體外進行傳代培養(yǎng)，通過免疫熒光染色得出的結果表明波形蛋白(vimentin)高表達和肌鈣蛋白(troponin)低表達(圖2A)。用pcDNA-NRON或siRNA NRON轉染心房成纖維細胞，轉染效率如圖2B所示，用pcDNA-NRON轉染的成纖維細胞中NRON的表達高于用pcDNA-vector質粒轉染的成纖維細胞，NRON在si-NRON中的表達較低。使用Ang-Ⅱ誘導纖維化后使用CCK-8進行增殖能力檢測，結果顯示NRON過表達抑制了成纖維細胞增殖，而si-NRON促進了增殖(圖2C)。過度表達的NRON明顯抑制了Ang-Ⅱ誘導的成纖維細胞中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達，而si-NRON組與pcDNA組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2D)。NRON明顯誘導NFATc3磷酸化，從而導致Ang-Ⅱ誘導的成纖維細胞中p-NFATc3 / NFATc3的比例升高(圖2D、E)。如圖2F所示，藍綠色重疊表示成纖維細胞核中的NFATc3表達，Ang-Ⅱ處理組的NFATc3表達比對照組多，NRON過表達抑制了NFATc3從細胞質向細胞核的轉運。

2.3 過表達LncRNA NRON對Ang-Ⅱ誘導的小鼠心臟纖維化影響在動物實驗結束時測試了小鼠的心臟功能水平和相關的血液動力學指標，結果表明NRON過表達組顯著抑制了Ang-Ⅱ誘導的左室舒張末期直徑(left ventricular end distolicdimension,LVDd)、左室收縮末期直徑 (left ventricular end-systolicdimension,LVDs)、室間隔舒張末期厚度(inter-ventricular septal thickness at diastole，IVSd)、室間隔收縮末期厚度 (interventricular septal thickness at end-systole，IVSs) 的增加，并顯著促進了Ang-Ⅱ誘導的左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室射血縮短分數(left ventricular fraction shortening，LVFS)降低(表1)。HE染色結果顯示，與對照組比較，Ang-Ⅱ組心肌間質纖維紊亂的發(fā)生率更高，而核與核之間的距離更寬，但是pcDNA-NRON減輕了纖維化的發(fā)生率，使心肌間質纖維減少(圖3A)。通過Masson染色檢測心肌纖維化的程度，結果如圖3B所示，Ang-Ⅱ組心肌纖維明顯增厚且膠原纖維沉積很多。然而，pcDNA-NRON使心肌之間纖維減少變薄，從而改善纖維化。同時，膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、NFATc3和p-NFATc3的蛋白質水平結果顯示NRON過表達組顯著減少了Ang-Ⅱ誘導的心房組織膠原Ⅰ和膠原Ⅲ和NFATc3的表達(圖3C、D)。此外，NRON過表達株顯著提高了NFATc3的磷酸化水平，導致p-NFATc3/NFATc3的比例增加(圖3E、F)。以上的動物實驗數據顯示，過表達的NRON抑制了小鼠的心臟纖維化。

圖1 AF中NRON表達和心房纖維化蛋白表達

圖2 過表達NRON對心房成纖維細胞纖維化影響

表1 過表達NRON對小鼠心臟功能和血液動力學的影響

3 討論

LncRNA已顯示在許多心臟發(fā)育或心臟疾病中起關鍵作用[3]。LncRNA是一組非蛋白質編碼的RNA分子，長度大于200個核苷酸。LncRNA在過去曾被認為并不具有調控基因轉錄及蛋白翻譯的作用。但如今越來越多的證據支持LncRNA在健康和疾病中對基因表達調控的生物學意義[4]，它們已經參與了許多生物學過程，例如表觀遺傳調控、細胞周期控制、細胞分化、剪接、核/細胞質運輸以及轉錄/翻譯。最近，在心臟和血管系統(tǒng)中已經證明存在有幾種與調節(jié)功能相關的LncRNA，包括Braveheart、Fendrr、CHRF、MALAT、LIPCAR和SENCR[5-7]。但是，還需要研究其他與AF相關的LncRNA以便更好地了解AF的發(fā)病機制。

NFAT是一種受Ca2+調節(jié)以控制基因表達的轉錄因子家族，首次被發(fā)現于T淋巴細胞。NFAT的顯著特征是其受Ca2+和依賴Ca2+/鈣調蛋白的絲氨酸磷酸鈣調磷酸酶調節(jié)。CaN是一種依賴Ca2+/鈣調蛋白的磷酸酶，可將大量的磷酸蛋白去磷酸化[1]。盡管該酶在多種類型的組織和細胞中表達，但其與NFAT轉錄因子家族的核定位轉導的調節(jié)密切相關[2]。

有實驗[8]表示NRON在心肌組織中表達水平較高，并已通過影響其核運輸而被認為是NFAT的阻遏物。本研究，根據qRT-PCR分析得出結論，相對于SR組，AF組患者心房組織樣本lncRNA NRON的表達水平較低。已知NFAT是調節(jié)細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)和基因表達的關鍵蛋白，在心臟疾病中其表達和活性發(fā)生了很大變化。Sharma et al[9]發(fā)現敲除LncRNA NRON的細胞里出現NFAT的去磷酸化和核易位的大量增加，這與本研究關于AF中NRON增強的NFATc3磷酸化的發(fā)現一致。NRON對NFAT脫磷酸作用的抑制作用先前歸因于其螯合參與核轉運的蛋白質的能力，特別是KPNB1、importin-beta和CSE1L，后者將importin-alpha從細胞核循環(huán)到細胞質。

磷酸化的NFAT1存在于大的細胞質RNA-蛋白質復合物中，該復合物包含支架蛋白，包含GTPase活化蛋白(IQGAP)，鈣調蛋白和3個NFAT激酶的IQ基序，酪蛋白激酶1，糖原合酶激酶3和雙重特異性酪氨酸磷酸化調節(jié)激酶。NRON和IQGAP1的組合敲低增加了刺激后NFAT的去磷酸化和核輸入。支架復合物不僅將NFAT定位在促進其在細胞質中處于失活狀態(tài)的維持激酶附近，而且還可能阻礙鈣調神經磷酸酶在靜息細胞中接近NFAT，并且還可以作為核轉運因子和所需鈣調蛋白的儲庫在刺激的細胞中激活鈣調神經磷酸酶。此外，NRON還通過以下途徑抑制成纖維細胞增殖抑制NFAT活性，這一結果與腫瘤細胞的作用一致[10]。結合以上結論分析，作為NFAT的阻遏物，NRON是AF中一種抑制纖維化的LncRNA，并可以影響AF的進展過程。

本研究揭示了NRON與AF和心房心肌的纖維化進程有關。此外，驗證了NRON抑制成纖維細胞的增殖以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達。臨床證據和體外分析均表明NRON可通過促進AF中NFATc3磷酸化來減輕心房纖維化。這一發(fā)現為AF在分子層面的發(fā)展機制提供了新的見解，有望為AF治療提供新的干預靶點。

圖3 過表達NRON對Ang-Ⅱ誘導的小鼠心臟纖維化影響