盛 瑛，張宸銘，陳 亮，徐佰達(dá)，靳天慧，劉葉紅，葉 挺，宗剛軍,

血管鈣化是糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病在血管方面的特征性病理改變。一旦血管鈣化發(fā)生，將導(dǎo)致血壓波動(dòng)、斑塊破裂、血栓形成等嚴(yán)重后果[1-2]。研究[3]表明，血管鈣化與平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的成骨轉(zhuǎn)分化、炎癥、凋亡或外泌體的釋放均緊密相關(guān)。鈣化發(fā)生時(shí)主要表現(xiàn)為成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix及其下游成骨相關(guān)蛋白，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、BMP4、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等的表達(dá)增加[4]。目前，有關(guān)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子-β(transform growth factor-β，TGF-β)家族的BMP2、BMP4、BMP6促進(jìn)血管鈣化的研究較多，但尚未見(jiàn)同家族的生長(zhǎng)分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)在鈣化方面的報(bào)道。有研究[5-6]表明，補(bǔ)充外源性GDF11可逆轉(zhuǎn)高齡小鼠因老化導(dǎo)致的心臟、骨骼肌、腦血管疾病。還有研究發(fā)現(xiàn)，GDF11可以促進(jìn)破骨、抑制成骨分化過(guò)程[7]。該研究擬用β-甘油磷酸、地塞米松、L-抗壞血酸誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cell，HAEC)鈣化，探究外源GDF11對(duì)鈣化及其過(guò)程中成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料HAEC購(gòu)自上海子實(shí)生物科技公司，以該細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(endothelial cell growth supplement，ECGs)、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；胰蛋白酶、細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京碧云天公司；人源外源重組GDF11因子購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；一抗BMP2、BMP4、GDF11均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；內(nèi)參蛋白β-actin購(gòu)自美國(guó)ABSCI公司；二抗兔、FITC標(biāo)記熒光二抗兔均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司；HRP標(biāo)記二抗鼠購(gòu)自美國(guó)CST公司；引物Runx2、Osterix、GAPDH、GDF11購(gòu)自上海吉瑪生物科技公司；基因檢測(cè)熒光染料SYBR、逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自南京Vazyme公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)使用內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(ECM+ECGs+5%胎牛血清)，于5% CO2的37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)表面70%～80%時(shí)，進(jìn)行消化傳代，取3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以1×105/ml的細(xì)胞數(shù)密度種植于六孔板。

1.3 方法

1.3.1建立HAEC鈣化模型 以β-甘油磷酸為研究變量，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，分為空白對(duì)照組、低濃度組、高濃度組。空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)10 d；低濃度組予10 mmol/L β-甘油磷酸+100 nmol/L地塞米松+50 μg/ml L-抗壞血酸培養(yǎng)10 d；高濃度組予30 mmol/L β-甘油磷酸+100 nmol/L地塞米松+50 μg/ml L-抗壞血酸培養(yǎng)10 d。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組 以GDF11為變量，探討外源重組GDF11干預(yù)HAEC鈣化的有效濃度及時(shí)間：① GDF11預(yù)處理48 h，按濃度梯度分為5組：空白組、鈣化組、30 ng/ml組(30 ng/ml GDF11)、50 ng/ml組(50 ng/ml GDF11)、100 ng/ml組(100 ng/ml GDF11)；② 以100 ng/ml GDF11干預(yù)，按時(shí)間梯度分5組： 空白組、鈣化組、8 h組、24 h組、48 h組；③ 篩選出GDF11有效干預(yù)濃度與時(shí)間后，HAEC分4組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)：空白組(常規(guī)培養(yǎng)12 d)、GDF11組(予100 ng/ml GDF11預(yù)處理48 h、再常規(guī)培養(yǎng)10 d)、鈣化組(常規(guī)培養(yǎng)2 d后，予鈣化誘導(dǎo)10 d)、GDF11+鈣化組(予100 ng/ml GDF11預(yù)處理48 h，再鈣化誘導(dǎo)10 d)。

1.3.3Western blot 檢測(cè)BMP2(1 ∶1 000)、BMP4(1 ∶1 000)、GDF11(1 ∶2 000)、內(nèi)參蛋白β-actin(1 ∶3 000)。收集樣本，提取總蛋白，于 80 V恒壓電泳40 min左右，待marker分開(kāi)后，調(diào)至120 V恒壓電泳至上樣緩沖液脫落， 350 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min，5%BSA封閉1 h，孵育一抗(4 ℃過(guò)夜)，TBST洗膜5 min 5次，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜5 min 5次，滴加ECL曝光液進(jìn)行顯影，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4RT-PCR 檢測(cè)Runx2、Osterix、GDF11、GAPDH基因表達(dá)水平。鈣化誘導(dǎo)10 d后，收集細(xì)胞提取RNA，測(cè)RNA濃度，按Vazyme逆轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表1。

1.3.5茜素紅S染色 4%多聚甲醛中室溫固定細(xì)胞30 min，用PBS洗5 min 3次，pH 4.2的2%茜素紅S浸染爬片10 min，立即用PBS快速?zèng)_洗，直至洗液不變紅，用封片劑封片，于鏡下觀察。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 HAEC鈣化模型的建立及鈣化后內(nèi)源GDF11表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示(圖1)，高濃度組的BMP2、BMP4、GDF11蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組(P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示(圖2)，高濃度組Runx2、Osterix、GDF11的相對(duì)基因表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組(P<0.05)；茜素紅S染色結(jié)果顯示(圖3)，高濃度組的鈣化沉著高于空白對(duì)照組及低濃度組；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示(圖4)，高濃度組的GDF11熒光強(qiáng)度高于空白對(duì)照組及低濃度組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中鈣化組即高濃度組的誘導(dǎo)方案。

圖1 Western blot 檢測(cè)各組HAEC內(nèi)GDF11、BMP4、BMP2蛋白表達(dá)水平

圖2 RT-PCR檢測(cè)各組HAEC內(nèi)Runx2、Osterix、GDF11基因表達(dá)水平

2.2 外源GDF11對(duì)HAEC鈣化有效作用濃度和時(shí)間Western blot結(jié)果顯示(圖5)，100 ng/ml組BMP2 、BMP4蛋白低于鈣化組(P<0.05)，24 h組BMP2 、BMP4蛋白低于鈣化組(P<0.05)，24 h組與48 h組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后續(xù)GDF11+鈣化組均以100 ng/ml GDF11預(yù)處理48 h作為GDF11有效干預(yù)濃度和時(shí)間。

2.3 外源GDF11對(duì)鈣化相關(guān)蛋白及鈣化沉積的影響Western blot結(jié)果顯示(圖6)，GDF11+鈣化組BMP2、BMP4相對(duì)蛋白表達(dá)水平均低于鈣化組(P<0.05)，但GDF11組BMP2、BMP4蛋白表達(dá)水平與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；茜素紅S染色顯示(圖7)，GDF11+鈣化組鈣化沉積較鈣化組減少。

2.4 外源GDF11對(duì)鈣化的HAEC核內(nèi)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix的影響RT-PCR結(jié)果顯示(圖8)，與鈣化組比較，GDF11+鈣化組Runx2、Osterix基因表達(dá)水平均下降(P<0.05)，GDF11組Runx2、Osterix基因表達(dá)水平與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 各組HAEC鈣化沉著的茜素紅染色結(jié)果 ×400A:空白對(duì)照組；B:低濃度組；C:高濃度組； 箭頭指示粉紅色附著處為鈣化沉積

圖4 各組HAEC細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果 ×200

圖5 Western blot檢測(cè)各組HAEC經(jīng)不同濃度、時(shí)間外源GDF11預(yù)處理后BMP2、BMP4蛋白表達(dá)水平

3 討論

血管鈣化是由內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等相互作用，機(jī)械損傷、炎癥、新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等所支配的骨質(zhì)礦化的復(fù)雜過(guò)程[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管的最內(nèi)層結(jié)構(gòu)，最易受血流沖擊引起機(jī)械損傷及炎癥反應(yīng)。其次內(nèi)皮細(xì)胞與血液直接接觸，是多種分子的靶細(xì)胞，最易受到各種分子的作用。有研究[9-10]指出主動(dòng)脈瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞可分泌一氧化氮和C型尿鈉肽，從而調(diào)控瓣膜間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化，抑制間質(zhì)細(xì)胞鈣化。血管平滑肌細(xì)胞是血管間質(zhì)成分的一種，亦受內(nèi)皮細(xì)胞分泌物質(zhì)的調(diào)控。因此，研究動(dòng)脈內(nèi)膜的鈣化具有更顯著的現(xiàn)實(shí)意義。有研究表明高磷或高糖環(huán)境促進(jìn)HAEC成骨分化是血管鈣化機(jī)制之一[11-12]，所以抑制內(nèi)皮細(xì)胞向成骨分化的過(guò)程是抑制內(nèi)膜鈣化的重要機(jī)制之一，選取HAEC為研究對(duì)象，并對(duì)其鈣化進(jìn)程中所發(fā)生的成骨分化展開(kāi)研究，具有重要的臨床意義。

圖6 Western blot檢測(cè)各組HAEC內(nèi)BMP2、BMP4蛋白表達(dá)水平

圖7 茜素紅S染色檢測(cè)各組HAEC鈣化沉積 ×400

圖8 RT-PCR檢測(cè)各組HAEC內(nèi)Runx2、Osterix相對(duì)基因表達(dá)(n=3)

本研究中鈣化模型不同于以往已報(bào)道的是，既往常用10 mmol/L β-甘油磷酸誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞鈣化[13]，而HAEC需用更高濃度β-甘油磷酸(30 mmol/L)才能發(fā)生顯著鈣化。誘導(dǎo)HAEC鈣化后，BMP2、BMP4蛋白表達(dá)上調(diào)，其上游的成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix表達(dá)也上調(diào)，說(shuō)明該鈣化誘導(dǎo)方案可能經(jīng)Runx2/Osterix途徑[14]。在該鈣化模型中，GDF11的蛋白和基因表達(dá)同時(shí)上調(diào)。而目前研究[15-16]內(nèi)源GDF11表達(dá)者多聚焦于臨床范疇，且尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，可能與不同細(xì)胞系、不同疾病、年齡、GDF11的檢測(cè)方法等混雜因素有關(guān)[17-18]。但鈣化誘導(dǎo)后所表現(xiàn)的GDF11升高是負(fù)反饋性上調(diào)抑制鈣化還是僅作為一種促鈣化標(biāo)記物正反饋性上調(diào)不得而知。本研究便在鈣化誘導(dǎo)之前補(bǔ)充外源GDF11因子，發(fā)現(xiàn)BMP2、BMP4均下調(diào)；另外，外源GDF11也下調(diào)鈣化過(guò)程中的Runx2、Osterix基因表達(dá)水平。茜素紅染色提示GDF11從大體層面抑制了鈣化的發(fā)生，以上結(jié)果表明GDF11可能通過(guò)Runx2/Osterix途徑來(lái)抑制鈣化。鈣化組的GDF11表達(dá)雖上調(diào)，但鈣化相關(guān)蛋白并未下調(diào)，說(shuō)明高甘油磷酸誘導(dǎo)鈣化所致內(nèi)源GDF11的上調(diào)并不能抑制鈣化的發(fā)生，在補(bǔ)充一定濃度的外源GDF11后可見(jiàn)鈣化相關(guān)蛋白下調(diào)，鈣化沉積也減少。可能因?yàn)閮?nèi)源GDF11的濃度不足以抑制鈣化或外源GDF11通過(guò)反饋性抑制內(nèi)源GDF11的表達(dá)來(lái)抑制鈣化。

研究表明高濃度β-甘油磷酸、地塞米松、L-抗壞血酸可誘導(dǎo)HAEC鈣化，可能通過(guò)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2/Osterix正性調(diào)節(jié)下游鈣化蛋白的表達(dá)，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。并發(fā)現(xiàn)外源GDF11可能通過(guò)Runx2/Osterix途徑抑制HAEC鈣化，本研究證實(shí)GDF11在體外可抑制HAEC鈣化的進(jìn)展，為血管內(nèi)膜鈣化的治療提供了干預(yù)的靶點(diǎn)，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。