王華斌，干曉琴，丁勇利，李永文，劉智濤，李玥樺

宮頸癌是一種婦科生殖道惡性腫瘤，主要由于高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)持續(xù)感染所致。目前已成為危害全球女性健康的重大疾病，且新發(fā)病率和死亡率還在持續(xù)上升[1-2]。宮頸癌中鱗狀細(xì)胞癌占比高達(dá)75%～80%，而鱗狀細(xì)胞癌中HPV16基因型最多見。研究[3]表明宮頸癌Caski細(xì)胞含有完整的HPV16型基因，因而對(duì)其進(jìn)行研究并找到控制方法意義重大。醌茜素即1,2,5,8以-四羥基蒽酮(1,2,5,8-tetrahydroxyanthraquinone，Quinalizarin)是一類蒽醌類化合物，主要存在于鼠李科植物翼核果內(nèi)[4]。研究[5]表明醌茜素能抑制人肝癌Huh7細(xì)胞增殖和存活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。較高濃度的醌茜素能夠有效抑制人肺癌A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可能成為靶向治療非小細(xì)胞肺癌的新型藥物[6-7]。但醌茜素對(duì)宮頸癌的作用卻少有報(bào)道，該文旨在探究醌茜素對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡和自噬的影響及其作用機(jī)制，從而為宮頸癌治療提供可能的參考方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠(6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g),購(gòu)自四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK(川)2018-15；人宮頸癌Caski細(xì)胞(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。RPMI 1640培養(yǎng)基、四季青胎牛血清、醌茜素(德國(guó)MERCK公司),BrdU、5-氟尿嘧啶(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)，胰蛋白酶、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(美國(guó)Sigma公司)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)(廣州華大基因科技有限公司)，兔來源Actin、Ki67、ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、AKT、p-AKT、PI3K、mTOR、p-PI3K、p-mTOR、Cleaved caspase-3、caspase-3、LC3單克隆抗體(美國(guó)CST公司)，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞測(cè)定儀(美國(guó)Becton-Dickinson公司)，激光共聚焦顯微鏡(FV3000)(日本奧林巴斯公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌Caski細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d換液1次，本實(shí)驗(yàn)中均使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3 BrdU染色觀察細(xì)胞增殖在細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入BrdU(1 mg/ml)，37 ℃孵育48 h。棄培養(yǎng)液，玻片用PBS洗滌3次，4%PFA固定30 min。固定好的玻片用PBS洗滌3次，于2 mol/L HCl中37 ℃變性5 min。用0.1 mol/L的硼酸鈉(pH=8.3)中和10 min，PBS洗滌3次。加入1 ml Triton X-100，浸泡10 min后吸出再用PBS洗滌3次。加入1 ml 3%的BSA封閉，于室溫放置1 h后吸出再用PBS洗滌3次。加入一抗即抗小鼠BrdU單抗，用1%BSA稀釋，4 ℃過夜后用PBS洗滌3次。細(xì)胞核用DAPI染色。之后在顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量變化及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)宮頸癌Caski細(xì)胞凋亡方法來自其使用說明書。凋亡率用Annexin-V 陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.5 Western blot檢測(cè)增殖、凋亡、自噬以及PI3K通路磷酸化相關(guān)蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞，用生理鹽水洗滌2次，然后用含有蛋白酶抑制劑RIPA裂解緩沖液裂解，提取總蛋白并測(cè)定濃度。取30 μg，用5×buffer上樣12%SDS-PAGE電泳分離，然后移到硝酸纖維素膜上，用脫脂乳封閉1 h，敷上相應(yīng)的兔來源單克隆抗體(Actin 1 ∶1 000、Ki67 1 ∶1 000、ATG5 1 ∶1 500、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 1 ∶2 000、p62 1 ∶1 000、AKT 1 ∶800、p-AKT 1 ∶1 000、PI3K 1 ∶1 000、mTOR 1 ∶1 000、p-PI3K 1 ∶1 000、p-mTOR 1 ∶1 000、Cleaved caspase-3 1 ∶1 000、caspase-3 1 ∶1 000)在4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗(1 ∶2 000)孵育1 h后，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

圖1 不同濃度醌茜素處理對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖能力的影響 A：BrdU染色觀察細(xì)胞增殖×100；B：BrdU陽性細(xì)胞所占比例統(tǒng)計(jì)；C：Western blot檢測(cè)增殖標(biāo)記蛋白Ki67表達(dá)；1：對(duì)照組；2：醌茜素1 μmol/L組；3：醌茜素4 μmol/L組；4：醌茜素12 μmol/L組；5：5-氟尿嘧啶組；與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖2 不同濃度醌茜素處理對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 A：流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；B：Western blot檢測(cè)凋亡標(biāo)記蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)；C：凋亡標(biāo)記蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)統(tǒng)計(jì)；1：對(duì)照組；2：醌茜素1 μmol/L組；3：醌茜素4 μmol/L組；4：醌茜素12 μmol/L組；5：5-氟尿嘧啶組；與對(duì)照組比較：*P<0.05

1.6 免疫熒光檢測(cè)LC3的含量和AKT的細(xì)胞膜陽性定位情況將細(xì)胞接種于玻片上，處理后，用PBS洗滌3次，每次3 min。用4%PFA固定15 min，PBS浸洗3次；然后用0.5%Triton X-100室溫通透10 min，PBS浸洗3次，用5%BSA于室溫下封閉45 min后，滴加相應(yīng)兔來源單克隆抗體(LC3 1 ∶2 000、AKT 1 ∶1 000)于4 ℃過夜孵育。PBS清洗3次，滴加相應(yīng)的熒光二抗，濕盒中20～37 ℃孵育1 h，用PBS進(jìn)一步洗滌3次后。細(xì)胞核用DAPI染色。然后在激光共聚焦顯微鏡上觀察。

1.7 構(gòu)建移植瘤裸鼠模型并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在若干只裸鼠的右前部背部皮下注射細(xì)胞密度為5×109/L 的CaSki細(xì)胞，篩選出正常形成移植瘤的小鼠。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩組，一組為裸鼠模型組，另一組為移植瘤加藥組(灌胃醌茜素30 mg/kg[8])。一段時(shí)間后處死裸鼠，皮下剝離腫瘤組織，觀察其形態(tài)并稱重。

1.8 免疫組化檢測(cè)Ki67、Caspase-3、ATG5的表達(dá)腫瘤標(biāo)本用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片并用蘇木精-伊紅染色和EnVision兩步法進(jìn)行免疫組化染色。將切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水，用pH 8.0 的1 mmol/L EDTA緩沖液高壓修復(fù)抗原，加入兔來源單克隆抗體(KI67 1 ∶1 000、Caspase-3 1 ∶1 000、ATG5 1 ∶800)4 ℃過夜孵育，用Dako Rubbit/Mouse EnVision/HRP復(fù)合物室溫孵育40 min，DAB鏡下顯色，蘇木精襯染，常規(guī)脫水至透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 醌茜素能夠抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞用不同濃度(0、1、4、12 μmol/L)的醌茜素處理，以5-氟尿嘧啶組(5 μmol/L)作為陽性對(duì)照。經(jīng)過BrdU染色顯示，宮頸癌CaSki的BrdU陽性細(xì)胞率隨著醌茜素濃度增加而逐漸減弱(圖1A、B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.234，P=0.004)；對(duì)標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的抗原蛋白Ki67進(jìn)行定量檢測(cè)，顯示其表達(dá)量隨著醌茜素濃度增加而明顯降低(圖1C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.422，P=0.008)；說明醌茜素能夠抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖。

2.2 高濃度醌茜素能夠誘導(dǎo)宮頸癌CaSki細(xì)胞發(fā)生凋亡從流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果來看，以0、1、4、12 μmol/L醌茜素和5-氟尿嘧啶處理同一狀態(tài)的宮頸癌CaSki細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別為(13.62±4.16)%、(17.36±4.21)%、(23.73±4.35)%、(38.82±5.06)%、(44.42±5.12)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.674，P=0.005)。Western blot結(jié)果顯示，促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表達(dá)水平隨著醌茜素濃度增加而不斷升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.205，P=0.006)。說明高濃度醌茜素能夠誘導(dǎo)宮頸癌CaSki細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖2。

2.3 高濃度醌茜素能促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬為了檢測(cè)不同濃度醌茜素對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬的影響，采用0、1、4、12 μmol/L醌茜素處理細(xì)胞，分別檢測(cè)自噬標(biāo)記分子ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及自噬底物p62變化。結(jié)果如圖3A顯示ATG5的表達(dá)水平隨醌茜素濃度增加而逐漸降低，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值卻是逐漸增大，p62的表達(dá)量逐漸增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.346，P=0.006；F=16.154，P=0.008；F=15.142，P=0.009)。因此醌茜素能夠促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬。免疫熒光檢測(cè)LC3的含量結(jié)果如圖3B所示：對(duì)照組、醌茜素12 μmol/L組、 3-MA組、3-MA+醌茜素12 μmol/L組單個(gè)細(xì)胞LC3斑點(diǎn)數(shù)分別為(3.12±0.16)、(29.33±0.87)、(1.02±0.12)、(6.45±0.67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.34，P=0.000)。Western blot檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)情況，如圖3C所示，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.183，P=0.003)。單獨(dú)用自噬抑制劑3-MA處理后，顯示細(xì)胞自噬明顯被抑制，而當(dāng)12 μmol/L醌茜素和3-MA聯(lián)合處理Caski細(xì)胞時(shí)，自噬作用又恢復(fù)了，表明高濃度醌茜素確實(shí)能促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬。

圖3 不同濃度醌茜素和3-MA處理對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬的影響 A：Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)記分子ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及自噬底物p62表達(dá)水平；B：免疫熒光檢測(cè)LC3的含量 ×400 ；C：Western blot檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平；1：對(duì)照組；2：醌茜素12 μmol/L組；3：3-MA組；4：3-MA+醌茜素12 μmol/L組；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與3-MA組比較：#P<0.05

圖4 3-MA與高劑量醌茜素處理對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞PI3K通路磷酸化的影響

2.4 醌茜素通過抑制PI3K通路蛋白磷酸化以促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬和凋亡為了探索醌茜素對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞的促進(jìn)自噬和凋亡的作用機(jī)制，Western blot測(cè)定其PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平。如圖4A所示，組間PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.136，P=0.09；F=8.923，P=0.012；F=12.312，P=0.010)。用高濃度(12 μmol/L)醌茜素單獨(dú)處理宮頸癌CaSki細(xì)胞后，能夠抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化，而單獨(dú)使用3-MA會(huì)促進(jìn)其磷酸化，二者聯(lián)合使用時(shí)這些蛋白磷酸化水平又降低，說明醌茜素能夠逆轉(zhuǎn)3-MA對(duì)PI3K通路磷酸化的促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)CaSki細(xì)胞自噬。而后通過免疫熒光檢測(cè)抗凋亡蛋白AKT的細(xì)胞膜陽性定位(圖4B)，顯示醌茜素同樣可以恢復(fù)3-MA的促進(jìn)AKT的表達(dá)效應(yīng)，從而促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡。綜上說明醌茜素可以通過抑制PI3K通路蛋白磷酸化來促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬和凋亡。

2.5 構(gòu)建移植瘤裸鼠模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和醌茜素30 mg/kg組移植瘤重量分別為(0.28±0.07)、(0.10±0.04)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.912，P<0.05)。通過免疫組化檢測(cè)2組鼠內(nèi)Ki67、Caspase-3、ATG5的表達(dá)，顯示移植瘤裸鼠加藥組中Ki67、ATG5的表達(dá)量比對(duì)照組少，而Caspase-3的表達(dá)量比對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.238，P<0.05；t=2.279，P<0.05；t=3.167，P<0.05)，表明醌茜素能在裸鼠體內(nèi)抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞的增殖，能促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡和自噬。對(duì)2組鼠內(nèi)PI3K、AKT、mTOR的磷酸化情況進(jìn)行檢測(cè)，顯示移植瘤裸鼠加藥組中PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.123，P<0.05；t=11.642，P<0.05；t=8.642，P<0.05)，表明在裸鼠體內(nèi)醌茜素可能是通過抑制PI3K通路蛋白磷酸化來促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡和自噬的，與上面的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 對(duì)移植瘤裸鼠加藥處理后各項(xiàng)指標(biāo)變化情況 A：移植瘤圖片；B：免疫組化檢測(cè)Ki67、Caspase-3、ATG5表達(dá)水平；C：免疫組化檢測(cè)Ki67、Caspase-3、ATG5表達(dá)水平×200；D：Western blot檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平；與對(duì)照組比較：*P<0.05

3 討論

近幾年來宮頸癌對(duì)于全球女性健康的危害日益嚴(yán)峻，找到有效、高效治療方法已經(jīng)是迫在眉睫。目前對(duì)于宮頸癌的治療最首選的方法是通過藥物化療，然而臨床上常用的抗腫瘤藥物多有毒副作用大、價(jià)格較高的缺陷，因此從中藥中挖掘高效低毒、容易獲取、價(jià)格低廉的抗癌活性成分是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究[7,9-11]發(fā)現(xiàn)醌茜素對(duì)肝癌、肺癌、胃癌等細(xì)胞均具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，而且價(jià)格低廉，毒副作用較小，是很好的研究材料。本實(shí)驗(yàn)通過一系列細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等途徑證明了醌茜素對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞具有促凋亡和自噬的作用，并初步探索推測(cè)可能是通過抑制PI3K通路的磷酸化來發(fā)揮作用的。

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)自發(fā)調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡方式，它的正常運(yùn)行對(duì)于人體各項(xiàng)生命活動(dòng)具有重要作用[12]。腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞正常增殖能力改變和凋亡失衡的復(fù)雜綜合表現(xiàn)[13]。本實(shí)驗(yàn)中用不同濃度的醌茜素處理宮頸癌Caski細(xì)胞，顯示醌茜素能夠抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖，并且表現(xiàn)為明顯的濃度依懶性。經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，表明醌茜素能夠誘導(dǎo)宮頸癌CaSki細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且隨著濃度升高，細(xì)胞凋亡率也是逐漸上升。經(jīng)過Western blot檢測(cè)，顯示Ki67和caspase-3的表達(dá)量變化也與醌茜素的濃度呈依懶性，從而進(jìn)一步說明醌茜素能夠抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡。這一點(diǎn)與之前對(duì)胃癌、肺癌、肝癌細(xì)胞的影響是一致的[5-6]。

自噬是生物體內(nèi)一個(gè)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝需求和細(xì)胞器更新的高度保守的自然生理現(xiàn)象。通過檢測(cè)用不同濃度醌茜素處理的宮頸癌CaSki細(xì)胞內(nèi)ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ以及自噬底物p62的變化，顯示醌茜素能夠促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬。之后用自噬抑制劑3-MA和高濃度(12 μmol/L)醌茜素單獨(dú)或聯(lián)合處理宮頸癌CaSki細(xì)胞，并檢測(cè)其LC3的含量和斑點(diǎn)數(shù)量以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，表明高濃度醌茜素能夠扭轉(zhuǎn)3-MA的自噬抑制作用，進(jìn)一步證明高濃度醌茜素能誘導(dǎo)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬。用不同濃度醌茜素處理的宮頸癌CaSki細(xì)胞時(shí)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值是逐漸增大，自噬底物p62的表達(dá)量也是逐漸增多的，這說明醌茜素的濃度升高可能導(dǎo)致宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬小體降解過程受到抑制，也就是說高濃度醌茜素會(huì)抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬下游進(jìn)程。

有研究[14]表明，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路涉及多項(xiàng)細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖、代謝及細(xì)胞凋亡等，而且在腫瘤細(xì)胞的增殖、自噬、轉(zhuǎn)移及存活上有重要調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)中為了探索醌茜素是否是通過抑制PI3K通路磷酸化來抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬和凋亡，對(duì)用高濃度(12 μmol/L)醌茜素和3-MA單獨(dú)或聯(lián)合處理的宮頸癌CaSki細(xì)胞內(nèi)的PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)，加上AKT的細(xì)胞膜陽性定位結(jié)果，表明醌茜素可能是通過抑制PI3K通路蛋白磷酸化來促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞自噬和凋亡。另外，有研究[15]表明沉默CD276基因的表達(dá)能明顯抑制宮頸癌Caski細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡，作用機(jī)制可能與白細(xì)胞介素-8、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的蛋白水平有關(guān)，那么醌茜素對(duì)CD276基因的表達(dá)是否有影響，還需要進(jìn)一步研究。