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        血漿外泌體miR-1183在結直腸腫瘤中的表達及診斷價值研究

        2021-01-18 11:44:44張士龍吳文涌
        安徽醫(yī)科大學學報 2020年12期
        關鍵詞:外泌體腺瘤直腸

        張士龍,吳文涌

        我國結直腸癌綜合發(fā)病率和病死率分別排第三和第五位,總體呈現持續(xù)上升趨勢[1- 2]。超過半數的臨床首診患者因出現了轉移而錯過最好診療時段,導致預后不佳。因此,探尋有效的結直腸腫瘤早期預警標志對患者預后和生存狀況的改善具有重要價值。外泌體被稱為腫瘤進展的"探路者",在腫瘤進展全過程均扮演重要角色[3]。外泌體 miRNAs 在血液中穩(wěn)定性好、豐度較高,在腫瘤早篩早診、疾病監(jiān)測、療效評價等方面具有強大的標志物潛能。miR-1183在多種腫瘤中均有研究[4-7],但miR-1183在結直腸癌血液外泌體中的表達及臨床價值尚不清楚。該實驗通過測定結直腸癌、結直腸腺瘤和健康對照3組血漿樣本中外泌體miR-1183的表達情況,檢驗其表達水平與臨床病例特征的相關性,旨在對外泌體miR-1183在結直腸腫瘤中的診斷價值進行初步探討。

        1 材料與方法

        1.1 病例資料血液樣本來源于2018年6月—2019年12月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院高新院區(qū)胃腸外科一病區(qū)收治的80例結直腸癌患者。男性44例,女性36例,年齡36~81(57.33±12.46)歲;0~Ⅱ期39例,Ⅲ~Ⅳ期41例。患者均是首診未治,病理確診為結直腸癌,無其他重大疾病和腫瘤,樣本采集于術前。70例結直腸腺瘤和70例健康血樣本分別收集于內鏡室和體檢部門。此研究經安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的審批,參與者均簽有知情同意書。

        1.2 血漿樣本的采集EDTA抗凝管采集外周靜脈血10 ml,通過4 ℃離心機3 500 r/min,10 min離心處理,血漿轉至Eppendorf 管后儲存于-80 ℃冰箱。

        1.3 血液外泌體提取與鑒定

        1.3.1提取 使用0.22 μm濾器過濾血漿樣本;按照exoEasy Maxi Kit試劑盒(Qiagen,美國)操作手冊規(guī)范提取血漿外泌體。其應用膜親和性原理,用特定的 XBP 緩沖液與等體積血漿進行混合稀釋,于 exoEasy離心柱內離心,所得液體10 ml XWP緩沖液洗滌,最后使用400 μl XE緩沖液孵育,2次洗脫,離心獲得外泌體液。

        1.3.2透射電子顯微鏡及納米粒徑分析(nanoparticle tracking analysis,NTA) 備外泌體液,吸取樣本5~10 μl 滴加于銅網,沉淀3 min,在濾紙邊緣處吸去浮液;常溫干燥2 min,通過JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)成像觀察。NTA于廣州表觀生物科技有限公司進行檢測并分析。

        1.3.3流式分析 使用100 μl外泌體液,密封冰上保存;將不染色外泌體的樣品設為陰性對照,記為NC;樣品分別以CD63和CD81抗體進行染色,記為CD63和CD81;按照BD accuri C6 flow cytomenter儀器操作規(guī)范上機檢測。

        1.4 外泌體RNA提取及qRT-PCR檢測按照exoEasy Maxi Kit試劑盒提取血漿外泌體總RNA,NanoDrop 2000檢測RNA 濃度。取2 μl總RNA作為模板,按照miScript ll RT Kit試劑盒進行逆轉,再以miScript SYBR Green PCR Kit進行擴增。逆轉錄miRNA引物由上海吉瑪設計(miR-1183:RT 引物:5′-CACTGTAGGTGATGGTGAGAGTGGCA-3′,PCR引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′);外參miR-39-1(Spike-In Control購自Qiagen,美國)。應用2-ΔCt法計算miR-1183的相對表達量,ΔCt=CtmiR-1183-CtmiR-39-1。

        2 結果

        2.1 血漿外泌體提取和鑒定通過透射電子顯微鏡、流式分析和NTA對提取的血漿外泌體特性進行鑒定。在透射電鏡下放大196 000倍后觀察提取的1例結直腸癌患者和1名健康對照者的血漿外泌體,可見提取到的血漿外泌體為茶托樣雙層脂質膜結構,大小均<200 nm(圖1A);CD63 和CD81為定位于外泌體膜上的蛋白標志物,經流式分析1例腫瘤樣品中CD63和CD81兩個表面蛋白的表達情況,經檢測2個蛋白均有陽性信號,陽性率分別為50.5%和85.1%(圖1B) ;NTA示外泌體粒徑為95~265 nm,在145 nm處富集,對其定量后濃度約為3.55×109個顆粒/ml(圖1C) 。

        2.2 血漿外泌體miR-1183表達水平分析qRT-PCR對80例結直腸癌患者、70例結直腸腺瘤患者和70例健康對照者的血漿外泌體miR-1183水平進行檢測。以Kruskal-Wallis檢驗分析3組血漿外泌體miR-1183的表達差異,結果顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)。以Mann-Whitney U檢驗分析2組血漿外泌體之間miR-1183的表達差異,結果顯示,血漿外泌體miR-1183的表達水平在癌組高于健康對照組(P<0.000 1),腺瘤組亦高于健康對照組(P=0.001 8),并且在癌組也高于腺瘤組(P<0.000 1)(圖2)。

        圖1 血漿外泌體的鑒定

        2.3 血漿外泌體miR-1183表達和臨床特征相關分析Mann-Whitney U 檢驗對結直腸癌血漿外泌體miR-1183的表達與臨床特征間相關性進行分析,結果表明結直腸癌血漿外泌體 miR-1183的表達與病理分期、N分期、M分期、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)水平相關,而與患者年齡、性別、T分期、分化程度、病灶位置和部位無相關(表1)。同法分析結直腸腺瘤血漿外泌體miR-1183的表達與臨床特征的相關性,結果顯示結直腸腺瘤血漿外泌體 miR-1183表達與患者的血清CEA水平呈正相關,而與患者年齡、性別、病灶位置和部位無相關(表2)。

        圖2 qRT-PCR檢測miR-1183在健康對照組、結直腸腺瘤者、結直腸癌者血漿外泌體中的表達水平與健康對照組比較:**P<0.01,***P<0.001

        2.4 血漿外泌體miR-1183對結直腸腫瘤的診斷效能ROC曲線結果表明,血漿外泌體miR-1183鑒別結直腸癌患者和健康者的95%CI為0.829 9~0.941 5(P<0.000 1),靈敏度為78.75%,特異度為84.29%,截斷值為0.023 2;鑒別腺瘤患者和健康者的95%CI為0.742 1~0.886 9(P<0.000 1),靈敏度為68.57%,特異度為84.86%,截斷值為0.020 1。鑒別結直腸腫瘤患者和健康者的95%CI為0.795 2~0.909 7(P<0.000 1),靈敏度為74.00%,特異度為84.09%,截斷值為0.022 9;鑒別結直腸良惡性腫瘤的95%CI為0.650 1~0.810 6(P<0.000 1),靈敏度為47.5%,特異度為91.43%,截斷值為0.040 4。見圖3。

        3 討論

        盡早發(fā)現和干預是有效提高結直腸腫瘤患者生存預后的關鍵。在中國,結直腸腫瘤常規(guī)篩查仍未普及,通常應用糞便潛血試驗、問卷調查等方法進行初篩,結腸鏡作為二次篩查[8]。在鄭樹教授等人發(fā)表的《中國大腸癌流行病學及其預防和篩查白皮書》中提到,我國結直腸癌早診率只有5%~10%,60%以上的患者初診時已經是Ⅱ期或晚期。由此可見,我國結直腸腫瘤篩查工作還有待提升和加強。

        循環(huán)miRNAs的主要來源是被囊泡包裹穩(wěn)定存在的miRNAs[9],這種囊泡被認為可由所有的細胞(包括腫瘤細胞)分泌,外泌體是30~150 nm大小的囊泡,它包含供體細胞的DNA、mRNA、各類ncRNA、蛋白質、脂類物質等活性分子, 研究[10-11]表示腫瘤來源的外泌體在觸發(fā)腫瘤轉移機制、重塑腫瘤轉移微環(huán)境、協(xié)助腫瘤免疫逃逸等方面扮演了重要角色。血漿外泌體miRNAs等為代表的液體活檢新技術和分子層面?zhèn)€體化篩查策略是未來重要的發(fā)展方向,有望完善結直腸腫瘤的臨床篩查指南[12]。

        表1 miR-1183在結直腸癌血漿外泌體中表達水平與臨床病理特征的相關性

        表2 miR-1183在結直腸腺瘤血漿外泌體中表達水平與臨床特征的相關性

        圖3 ROC曲線分析血漿外泌體miR-1183分別對結直腸癌、結直腸腺瘤、結直腸腫瘤和結直腸良惡性腫瘤的診斷或鑒別潛能A:結直腸癌;B:結直腸腺瘤;C:結直腸腫瘤;D:結直腸良惡性腫瘤

        該研究旨在對外泌體miR-1183在結直腸腫瘤中的診斷價值進行初步探討。第一步純化的血漿外泌體,對其特性進行鑒定。其次,通過 qRT-PCR 分析外泌體miR-1183的表達情況,顯示結直腸腫瘤患者血漿外泌體miR-1183的表達與健康組相比上調,AUC為0.852 5,表明 miR-1183對結直腸腫瘤具有較高的診斷效能。結直腸良惡性腫瘤組與健康組相比顯示,血漿外泌體miR-1183在腫瘤早-晚期各階段中的表達呈現梯度上調指向,其對結直腸癌和腺瘤的AUC 結果分別為0.885 7和0.814 5。其在鑒別結直腸良惡性的0.730 4,95%CI為0.650 1~0.8106。均具有較高的診斷效能。此外,在分析結直腸腫瘤患者中miR-1183的表達與臨床特征關系時,顯示結直腸癌血漿外泌體 miR-1183表達與病理分期、N分期、M分期、血清CEA水平相關,提示miR-1183的表達與結直腸癌的疾病進展相關,血漿外泌體miR-1183具有作為結直腸腫瘤輔助或分層診斷的指標。

        綜上,本研究表明血漿外泌體miR-1183可能成為結直腸腫瘤早期預警標志物。該研究為臨床結直腸腫瘤(特別是腺瘤階段)的篩查和診斷提供了無創(chuàng)、簡便而有效的新方向,其靈敏性和特異性與傳統(tǒng)的糞便潛血試驗、CEA標志物等項目比較,有了極大的提高[14-15]。此次研究也有許多不足之處: ① 樣本入組時間較近,無法獲得入組患者隨訪信息,從而未能進行生存分析及預后風險評估; ② 未進一步探索的外泌體miR-1183在結直腸腫瘤中可能涉及的功能及機制。③ 樣本量相對小,不能排除個體差異的隱性影響[16]。若要開發(fā)血漿外泌體miR-1183作為分子指標應用于臨床,仍需擴大樣本,進行多中心更深入的研究。此外,需要進一步完善血液外泌體相關的實驗方法和理論,深入探討血漿外泌體miRNAs在腫瘤領域發(fā)揮的重要作用。

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