徐靜 朱國慶 周義浪 王敏 孫麗娥 蔣梅

（貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科 貴州 貴陽 550003）

魚腥草是一類在東南亞地區(qū)或國內南方地區(qū)大規(guī)模生長的三白草科蕺菜，其主要功效為：清熱解毒、利尿通淋等。有研究者對魚腥草的藥理作用進行研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草除上述作用外，還有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒等功效[1]。黃酮類化合物是一類多酚化合物，在多類植物中都廣泛存在，能夠阻礙細胞的增殖，對細胞凋亡產(chǎn)生誘導，同時還可對抑癌基因的活性產(chǎn)生加強作用，并對癌基因的表達產(chǎn)生抑制作用[2]。本研究在研究開始前，對魚腥草總黃酮化合物的成分和含量進行檢測和分析，并在此基礎上圍繞其對人肝癌細胞BEL-7402生長的阻抑作用進行研究，期望對魚腥草的抗癌作用機理進行詳細闡述，為魚腥草在臨床抗腫瘤的實際運用中提供參考。

1.資料與方法

1.1 藥材

本研究于2016年8月在貴陽市百宜鄉(xiāng)和遵義市的新浦區(qū)魚腥草種植基地內選取本研究所用的新鮮魚腥草的根和葉。送至貴陽中醫(yī)學院藥學院進行鑒定，確定本研究所采取的魚腥草是三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草。

1.2 試劑與細胞株

本研究使用的試劑有：二甲基亞砜（DMSO）（由江西洪瑞生物技術有限公司提供）、四甲基偶氮唑藍干粉（同上）、碘化丙啶（同上）。AnnexinV-FITC/FITC雙染試劑盒（同上）。蘆丁是本研究自行配制的，其濃度＞98%。AB-8型大孔吸附樹脂由天津南開大學化工廠提供。

人肝癌細胞BEL-7402由武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.3 黃酮提取物樣品溶液的配制

對粗提取物進行稱量，將適量的黃酮提取物放入無血清培養(yǎng)基中溶解，配制濃度為6.4g/L的母液，使用規(guī)格為0.22μm的濾膜進行過濾，然后將其封存放置于溫度為4℃的環(huán)境中留存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞培養(yǎng)

將人肝癌細胞BEL-7402放置在無菌DMEM細胞發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)擰培養(yǎng)，并將其放置在環(huán)境溫度為37℃，CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每隔3天左右的時間對細胞進行一次傳代，選取生長期為對數(shù)的細胞作為本研究的樣本細胞。

1.5 魚腥草總黃酮提取物對人肝癌細胞BEL-7402體外增殖的作用研究

運用DMEM培養(yǎng)液，對人肝癌細胞BEL-7402進行稀釋，配制成0.5×108L-1的細胞懸液，并在96孔板上進行接種，各孔均有100μL的培養(yǎng)液和5000個細胞，將其放置在環(huán)境溫度為37℃，CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞完全貼壁后，將濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L的魚腥草總黃酮化合物分別加入到培養(yǎng)板中，各個濃度水平的藥物均設置了3個復孔，并設置不添加任何藥物的細胞以及添加溶劑的細胞作為對照組，同時還設置調零孔，將其放置在環(huán)境溫度為37℃，CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，時間為48小時。

1.6 細胞凋亡的檢測

運用AnnexinV/P I雙染-流式檢測方法，對細胞凋亡的水平進行檢測。在6孔板中，將對數(shù)生長期的細胞接種于此，人肝癌細胞BEL-7402的濃度水平是2.5×108L-1，各孔的接種量為2ml，將其放置在環(huán)境溫度為37℃，CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞完全貼壁以后，吸取培養(yǎng)液后放棄，將藥物濃度為0.5g/L、0.8g/L、2.0g/L的無血清DMEM培養(yǎng)液分別加入其中，并設置對照孔，繼續(xù)進行培養(yǎng)，時間為48小時。

1.7 統(tǒng)計學方法

2.結果

2.1 魚腥草總黃酮提取物對人肝癌細胞BEL-7402體外增殖的影響

MTT結果顯示，魚腥草總黃酮化合物的濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L時，會以濃度依賴性的形式，對人肝癌細胞BEL-7402的增殖產(chǎn)生阻抑作用，且魚腥草總黃酮化合物的濃度越大，抑制水平越高。

2.2 魚腥草總黃酮提取物對人肝癌細胞BEL-7402凋亡產(chǎn)生的影響

AnnexinV/P I雙染-流式檢測結果顯示，魚腥草總黃酮化合物發(fā)揮藥效后，當濃度為0.5g/L、0.8g/L，且作用48小時后，細胞凋亡的數(shù)量在一定程度上升，當濃度達到2.0g/L時，細胞凋亡水平達到最大值，總細胞凋亡水平為89.7%。其中在添加藥物的組中，早期凋亡的細胞水平在一定程度上有所增加。

3.討論

臨床醫(yī)學認為，魚腥草能夠清肺化痰，同時還能夠治療白血病、抵抗癌細胞和氧化放映。本研究開展前，曾通過研究發(fā)現(xiàn)，在魚腥草中，含有黃酮、生物堿等成分，且發(fā)現(xiàn)部分以魚腥草為主要藥材的藥品，如先魚湯、參慈膠囊等，可對肺癌細胞產(chǎn)生阻抑作用，效果十分理想。黃酮類化合物是一類多酚化合物，在多類植物中均可檢測出該物質，其潛在的藥用價值較高，目前臨床研究者熱衷于對其抗腫瘤的作用進行研究。本研究運用魚腥草總黃酮化合物對人肝癌細胞BEL-7402生長的抑制作用進行研究，結果顯示，在人肝癌細胞BEL-7402生長過程中，魚腥草總黃酮提取物可發(fā)揮顯著的阻抑作用，依據(jù)檢驗結果，設置不同濃度水平的藥物組，運用流式細胞儀，對魚腥草總黃酮化合物對人肝癌細胞BEL-7402生長的影響進行檢驗，結果顯示，在人肝癌細胞BEL-7402的生長過程中，魚腥草總黃酮化合物能夠阻抑作用。

綜上所述，在人肝癌細胞BEL-7402生長中，魚腥草總黃酮提取物可誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖。