王守梅，朱詩琦，周 睿，朱美琪，方 媛，張樹輝

在日常病理操作和制片過程中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)微小病變組織，一類是送檢組織較小，如內(nèi)窺鏡活檢組織；另一類是送檢組織較大，但病變區(qū)域特別小，有的僅有幾毫米，甚至僅有幾團(tuán)細(xì)胞。面對(duì)如此微小的病變組織，在經(jīng)過取材、脫水、包埋、切片及進(jìn)一步檢測時(shí)如何盡可能多地保留病變組織，作者結(jié)合自身經(jīng)驗(yàn)和學(xué)習(xí)探討，現(xiàn)就如何保證微小病變組織的制片質(zhì)量談幾點(diǎn)體會(huì)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器隨機(jī)選取2018年5月～2019年5月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科存檔的微小病變組織標(biāo)本，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各50例；貝索蘇木精染色液；貝索伊紅染色液；Leica ASP300全自動(dòng)脫水機(jī)、Leica EG1150石蠟包埋機(jī)、Leica RM2235石蠟切片機(jī)，Leica ST5020全自動(dòng)染色機(jī)、Leica CV5030封片機(jī)、Leica Bond Max全自動(dòng)免疫組化儀。

1.2 方法微小病變組織標(biāo)本對(duì)照組按照正常流程操作，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)以下幾方面進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，其余過程兩組相同。組織脫水和包埋后3～5 μm厚連續(xù)切片，后經(jīng)過漂片、烤片，在全自動(dòng)染封一體機(jī)中進(jìn)行染色和封片制作HE切片或制作白片進(jìn)行進(jìn)一步免疫組化檢測和其它檢測項(xiàng)目。

1.2.1取材操作 接收到10%中性緩沖福爾馬林固定的標(biāo)本后的第一關(guān)卡便是取材，標(biāo)本信息核對(duì)準(zhǔn)確無誤后，如果發(fā)現(xiàn)組織很小或病變區(qū)域很小時(shí)，首先可以將組織用伊紅做標(biāo)記后包入紗布或?yàn)V紙中防止標(biāo)本由于過小而失落[1]，其次在包埋盒中加入“少修條”以提醒工作人員在后續(xù)包埋時(shí)提高注意，最后初步判斷如需做進(jìn)一步檢測時(shí)直接在申請(qǐng)單上標(biāo)注出，在常規(guī)切片時(shí)直接切出相應(yīng)的白片以備用。

1.2.2包埋操作 包埋時(shí)可以先在包埋模具中注入一半量熔化的蠟液，然后將包埋模具置于冷臺(tái)上，用鑷子將組織轉(zhuǎn)移到包埋模具中[2]。在包埋過程中查見帶有少修條的包埋盒時(shí)應(yīng)當(dāng)特別注意，仔細(xì)觀察微小病變組織的包埋面，否則制作出來的切片會(huì)觀察不到組織的全層結(jié)構(gòu)，難以作出正確診斷。包埋大塊組織中的微小病變區(qū)域時(shí)，要注意包埋面的平整，防止修片時(shí)修掉病變區(qū)域。包埋結(jié)束時(shí)將少修條放在包埋框上方的液體石蠟上，待石蠟?zāi)毯笊傩迼l則會(huì)緊緊嵌入石蠟中(圖1)。

圖1 包埋時(shí)將少修條放在包埋框上方 圖2 在多張待檢白片上標(biāo)上序號(hào)，按序號(hào)漂片并做相應(yīng)檢測項(xiàng)目

1.2.3切片操作 在切片過程中發(fā)現(xiàn)帶有少修條的蠟塊時(shí)應(yīng)當(dāng)特別注意，仔細(xì)觀察微小病變區(qū)域的位置，切片時(shí)要用力均勻，少粗修多細(xì)修，隨時(shí)注意病變組織的暴露情況，一旦病變組織暴露，盡量原位原切，不更換新的刀口防止刀口間有距離差并避免新刀口靜電吸附。切片3～4 μm厚為佳，切忌邊切片邊調(diào)整厚度。

1.2.4加做檢測操作 在診斷過程中由于病變部分太小，大大增加了診斷的難度，有時(shí)候需加做免疫組化等指標(biāo)來輔助診斷。對(duì)于微小病變區(qū)域，有時(shí)候連續(xù)切片的同一蠟片條帶上，第一個(gè)蠟片與最后一個(gè)蠟片上的病變細(xì)胞數(shù)量差異較大。將需要做的檢測項(xiàng)目按照重要程度進(jìn)行排序，最重要的指標(biāo)放在首位，同時(shí)相應(yīng)的在切片上標(biāo)注序號(hào)，將第一個(gè)蠟片放在第一張切片上做排序中的第一個(gè)檢測項(xiàng)目(圖2)，將連續(xù)切片的最后一張行HE染色以確認(rèn)病變細(xì)胞多少。

1.3 染色HE染色：常規(guī)制作HE切片后，在70 ℃烘片機(jī)上烤片15 min，全自動(dòng)染封一體機(jī)(Leica ST5020全自動(dòng)染色機(jī)和Leica CV5030封片機(jī))進(jìn)行HE染色和封片：二甲苯10 min×3次、100%乙醇1 min、95%乙醇1 min、75%乙醇1 min、流水沖洗1 min、蘇木精8 min、分化液20 s、流水沖洗3 min、藍(lán)化液1 min、流水沖洗3 min、伊紅1 min、75%乙醇1 min、95%乙醇1 min、100%乙醇1 min×2次、二甲苯5 min×3次，封片后結(jié)束HE染色程序。免疫組化染色：將編號(hào)后的白片與醫(yī)師開據(jù)的重要檢測項(xiàng)目的序號(hào)一一對(duì)應(yīng)后使用Leica Bond Max全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行染色，機(jī)器設(shè)置程序：加熱抗原修復(fù)20 min，冷卻至室溫，PBS漂洗，3%H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，加一抗20 min，Post Primary 10 min，Polymer 10 min，DAB顯色10 min，蘇木精復(fù)染，水洗后將玻片從機(jī)器中取出，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 優(yōu)化和改進(jìn)操作后制作HE切片及免疫組化切片的檢測結(jié)果對(duì)比HE染色切片及免疫組化染色切片由兩名高級(jí)別病理醫(yī)師鏡下閱片進(jìn)行診斷及制片質(zhì)量打分。HE切片質(zhì)量及免疫組化切片質(zhì)量評(píng)分根據(jù)病變區(qū)域情況進(jìn)行評(píng)分：不能滿足診斷需求為1分，基本滿足診斷需求為2分，較好滿足診斷需求為3分，非常滿足診斷需求為4分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，惡性組織檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE切片質(zhì)量微小病變組織經(jīng)優(yōu)化和改進(jìn)操作后，內(nèi)窺鏡組織無遺漏現(xiàn)象，包埋組織集中，HE切片的切面較為完整，鏡下見組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)清晰，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 HE切片質(zhì)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比

2.2 免疫組化切片質(zhì)量微小病變組織蠟片越往后切病變組織越少，經(jīng)編號(hào)后切白片制作免疫組化切片，這樣就可以保證最前面的蠟片能進(jìn)行有診斷意義的檢測項(xiàng)目，免疫組化切片質(zhì)量評(píng)分，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。微小病變區(qū)域可較好地呈現(xiàn)在多張免疫組化片上，鏡下見組織結(jié)構(gòu)和染色定位清晰準(zhǔn)確，能較好地滿足診斷需求(圖3)。

表2 免疫組化切片質(zhì)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比

圖3 微小病變組織按序號(hào)進(jìn)行HE染色(A)和CK7(B)、CK19(C)、CK20(D)免疫組化檢測

3 討論

病變組織過小、診斷者缺乏相應(yīng)臨床經(jīng)驗(yàn)、取材和制片困難時(shí)，易發(fā)生漏診[3]。為了使小組織更醒目、更易識(shí)別，我們先將組織用伊紅滴染后包入紗布或?yàn)V紙中，隨后放入加了伊紅的10%中性緩沖福爾馬林中固定進(jìn)行浸染以減少伊紅褪色，日常操作中不同單位的改進(jìn)方法也不盡相同，有的單位使用蘇木精對(duì)小組織進(jìn)行染色固定也取得了良好的效果[4]。微小病變組織的制片難度較大，我們要謹(jǐn)防丟失醫(yī)師診斷的關(guān)鍵依據(jù)。一般常規(guī)制片過程中3～5 μm厚切片，也就是說沒有完全相同的2張切片，包括連續(xù)切片時(shí)相鄰的2個(gè)蠟片。尤其在微小病變組織中，連續(xù)切片的蠟條上面第一個(gè)蠟片與最后一個(gè)蠟片上的病變細(xì)胞數(shù)量差異很大，這時(shí)最大程度地保證重要診斷項(xiàng)目就是我們首要的任務(wù)。經(jīng)過長期的實(shí)踐，作者發(fā)現(xiàn)編號(hào)制片可以很好地滿足診斷需求。

在病理操作流程及制片過程中要非常小心，因?yàn)槊恳画h(huán)節(jié)均很重要，均可能影響到最終的制片質(zhì)量[5]。對(duì)待小組織，無論臨床醫(yī)師有無提醒注意，技術(shù)人員均要加倍注意，要有高度的責(zé)任心和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度，對(duì)病理操作流程的各個(gè)環(huán)節(jié)有充分的認(rèn)識(shí)和掌握，在日常工作中謹(jǐn)慎再謹(jǐn)慎，不斷地思考、總結(jié)和改進(jìn)，提高制片質(zhì)量，最大可能地保證醫(yī)師診斷的關(guān)鍵依據(jù)。