陳 靜，魯康洋，李明鳳，尹 玉,2，曹立宇,3，蔡永萍,2

骨肉瘤是好發(fā)于青少年的原發(fā)性骨腫瘤，惡性程度高，尤其行新輔助化療耐藥的患者預(yù)后差[1-2]。因此，化療耐藥成為制約骨肉瘤治療效果的瓶頸，探索化療耐藥機制及尋找逆轉(zhuǎn)靶點是骨肉瘤患者治療的一大難題。近年研究發(fā)現(xiàn)叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子1(Forkhead Box M1, FoxM1)在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥中扮演重要角色[3]。魯康洋等[4]報道FoxM1在耐藥骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，臨床骨肉瘤組織中FoxM1表達(dá)高的患者生存率較低。Isakoff等[5]認(rèn)為骨肉瘤對化療耐藥可能與多種因素有關(guān)，但其發(fā)生機制尚不清楚。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ATP binding cassette, ABC)是一種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，在多種腫瘤化療耐藥方面起重要作用[6]，ABCA8是ABC家族成員之一。有研究表明ABCA8的表達(dá)增高與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)[7]。但FoxM1是否通過調(diào)控ABCA8參與骨肉瘤對化療耐藥，目前尚未見報道。本文著重探討FoxM1是否通過增強ABCA8的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞對順鉑化療的耐藥，期望為臨床逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療耐藥提供新思路和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑骨肉瘤細(xì)胞系MG63購自中科院上海細(xì)胞庫。FoxM1抗體(克隆號ab175798)、β-actin抗體購于Abcam公司，ABCA8抗體(克隆號24351-1-AP)購自Proteintech公司。Thiostrepton(CAS：1393-48-2)購自Sigma公司；qRT-RCR試劑盒和Lipofectamine 2 000購自Invitrogen公司；ABCA8-shRNAs PLKO載體購自Sigma-Aldrich。順鉑購自南京制藥公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3天棄1次舊液，0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。課題組前期建立的順鉑耐藥細(xì)胞系MG63/R在含2 μg/mL順鉑培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長和傳代；前期建立的穩(wěn)定過表達(dá)FoxM1及對照組細(xì)胞分別命名為MG63/LV-FoxM1和MG63/LV-NC。

1.3 shRNA敲低ABCA8瞬時慢病毒載體細(xì)胞shRNA靶序列構(gòu)建到PLKO載體中，對構(gòu)建的載體進(jìn)行測序鑒定并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率。收集上述病毒上清，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)嘌呤毒素篩選建立ABCA8敲低細(xì)胞株。shRNA序列如下：ABCA8-sh1：5′-CCGGCATGGGTCATAGTATCTGATA CTCGAGTATCAGATACTATGACCCATGTTTTTTG-3′；ABCA8-sh2：5′-CCGGCCAAATTCTGTGTTCCTGTTTC TCGAGAAACAGGAACACAGAATTTGGTTTTTTG-3′；NTC：5′-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCG AGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT-3′。

1.4 qRT-PCR采用Trizol試劑提取總RNA。通過分光光度法測定RNA的純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄PCR，具體操作步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。FoxM1引物序列：上游5′-TGCAGCTAGGGATGTGAATCTT C-3′，下游5′-GGAGCCCAGTCCATCAGAACT-3′；ABCA8引物序列：上游5′-TGAAATGGAGCCGATCCT TC-3′，下游5′-AGTATTGCAGTGATTTGGCCTT-3′；18S引物序列：上游5′-CGGCGACGACCCATTCGA AC-3′，下游5′-GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3′。本組以18S rRNA為內(nèi)參。

1.5 Western blot法收集細(xì)胞后加入裂解液，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉1 h以上，再加入一抗FoxM1(1 ∶1 000稀釋)、ABCA8(1 ∶1 000稀釋)或β-actin(1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的兔二抗(1 ∶10 000稀釋)室溫孵育2 h，顯影。

1.6 染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)直徑10 cm平皿培養(yǎng)的骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG63/R中加入1%甲醛，37 ℃交聯(lián)固定DNA與蛋白質(zhì)10 mim。用冷PBS洗滌細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解法收集細(xì)胞，超聲處理10 min后，離心取上清。4 ℃孵育3 h，加入IgG beads，旋轉(zhuǎn)儀4 ℃過夜。對復(fù)合物清洗，純化的DNA片段通過qRT-PCR分析。加入FoxM1抗體為實驗組，不加抗體為陰性對照(CTR)。具體步驟參考EZ-ChIP試劑盒(Millipore)。運用生物信息學(xué)法在Ensemble：http://www.ensembl.org/indexhtml網(wǎng)站查找ABCA8基因上游2 000 bp的啟動子區(qū)域。用Jaspar http://jaspar.genereg.net/預(yù)測FoxM1在ABCA8基因上游啟動子區(qū)域(forkhead response elements, FHRE)的結(jié)合位點。引物序列叉頭反應(yīng)元件如下：5′-AGA TCTTTTCTTCTAGGGGTCTGAC-3′和5′-GAGGAGTA AGAGGCTCAACATGGT-3′；5′-TTTCACAGCGGCTGC ACTAA-3′和5′-AGCAGCATGAGAGCAGACTAATA CA-3′。

1.7 細(xì)胞增殖實驗將處于對數(shù)生長期的骨肉瘤貼壁細(xì)胞以每毫升2×104個細(xì)胞分別接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入DMSO、聯(lián)合使用4 μmol/L Thiostrepton或單獨使用2 μg/mL順鉑。第1～5天，每孔中加入新鮮配置的MTT溶液，37 ℃保存4 h后棄去液體，每孔加入150 μL DMSO，紫色結(jié)晶溶解，室溫?fù)u床搖10 min，490 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤耐藥細(xì)胞中FoxM1和ABCA8的表達(dá)課題組前期已獲得的骨肉瘤親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中分別采用qRT-PCR法和Western blot法檢測FoxM1和ABCA8 mRNA和蛋白的表達(dá)。qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示：骨肉瘤耐藥細(xì)胞中FoxM1和ABCA8的mRNA表達(dá)比親本細(xì)胞明顯升高(圖1A)。Western blot檢測結(jié)果顯示：耐藥細(xì)胞MG63/R的蛋白表達(dá)高于親本細(xì)胞MG63，以上數(shù)據(jù)表明FoxM1和ABCA8蛋白表達(dá)在耐藥細(xì)胞中比親本細(xì)胞明顯增高(圖1B)。

圖1 A.qRT-RCP法檢測MG63/R和MG63細(xì)胞中FoxM1和ABCA8 mRNA的表達(dá)，*P<0.05；B.Western blot法檢測MG63/R和MG63細(xì)胞中FoxM1和ABCA8蛋白的表達(dá)

2.2 FoxM1與ABCA8的相關(guān)性qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)FoxM1 MG63/LV-FoxM1中FoxM1與ABCA8的mRNA表達(dá)水平與對照組相比，其表達(dá)量明顯升高(圖2A)。Western blot檢測顯示，與對照組MG63/LV-NC相比，MG63/LV-FoxM1的FoxM1與ABCA8蛋白表達(dá)明顯升高(圖2B)。

圖2 A.qRT-PCR法檢測FoxM1過表達(dá)MG63/LV-FoxM1及對照組MG63/LV-NC中FoxM1及ABCA8 mRNA的表達(dá)，*P<0.05；B.Western blot法檢測MG63/LV-FoxM1和MG63/LV-NC細(xì)胞中FoxM1及ABCA8蛋白的表達(dá)

2.3 FoxM1抑制劑Thiostrepton與ABCA8表達(dá)的關(guān)系在耐藥細(xì)胞MG63/R中加入4 μmol/L Thiostrepton，處理24 h后檢測FoxM1及ABCA8的mRNA表達(dá)，48 h后檢測其蛋白表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示，4 μmol/L Thiostrepton處理后的骨肉瘤耐藥細(xì)胞FoxM1及ABCA8 mRNA表達(dá)明顯下降(圖3A)。Western blot結(jié)果顯示，4 μmol/L Thiostrepton處理組與DMSO組FoxM1與ABCA8蛋白表達(dá)相比，其表達(dá)量明顯下降(圖3B)。

圖3 A.qRT-PCR檢測FoxM1及ABCA8 mRNA的表達(dá)，*P<0.05；B.Western blot法檢測ABCA8及FoxM1蛋白的表達(dá)

2.4 抑制FoxM1或ABCA8對骨肉瘤細(xì)胞順鉑化療的影響在骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG63/R和FoxM1過表達(dá)細(xì)胞株MG63/LV-FoxM1中分別加入2 μg/mL順鉑+DMSO或2 μg/mL順鉑+4 μmol/L Thiostrepton，結(jié)果顯示：與DMSO組相比，Thiostrepton處理后，細(xì)胞增殖能力明顯降低(圖4A、B)。在MG63/R和MG63/LV-FoxM1中分別用shRNA敲低ABCA8，結(jié)果顯示，同NTC組相比，ABCA8 shRNA敲低組骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力亦明顯降低(圖4C、D)。

圖4 細(xì)胞增殖實驗顯示，MG63/R(A)和MG63/LV-FoxM1(B)中分別給予2 μg/mL順鉑+DMSO或2 μg/mL順鉑+4 μmol/L Thiostrepton，與DMSO組相比，聯(lián)合Thiostrepton處理后，細(xì)胞增殖能力明顯降低；在MG63/R(C)和MG63/LV-FoxM1(D)中分別給予2 μg/mL順鉑或shRNA敲低ABCA8，與NTC組相比，骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力亦明顯降低

2.5 ChIP實驗檢測FoxM1與ABCA8啟動子結(jié)合運用生物信息學(xué)預(yù)測ABCA8基因上游啟動子區(qū)域FHRE位點是-1 383～-1 373區(qū)域，具體作用序列是TCTTTTTTATA(圖5A)。ChIP結(jié)果顯示：與對照組相比，F(xiàn)oxM1在ABCA8啟動子區(qū)域富集(圖5B)。以上實驗結(jié)果表明FoxM1可能與ABCA8啟動子區(qū)域結(jié)合并促進(jìn)ABCA8轉(zhuǎn)錄。

圖5 A.運用生物信息學(xué)預(yù)測ABCA8基因上游啟動子區(qū)域FHRE位點；B.與CTR相比，F(xiàn)oxM1在ABCA8啟動子區(qū)域FHRE富集，表明FoxM1可能與ABCA8啟動子區(qū)域直接結(jié)合促進(jìn)ABCA8轉(zhuǎn)錄

3 討論

骨肉瘤是一種間葉組織來源常見的骨原發(fā)性高度惡性腫瘤，好發(fā)于青少年。目前，骨肉瘤治療采用術(shù)前新輔助化療和手術(shù)切除及術(shù)后輔助化療的綜合治療,標(biāo)準(zhǔn)化療方案包括甲氨喋呤、阿霉素和順鉑[1]。然而患者的生存率并未得到有效提高，新輔助化療耐藥的患者易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療困難，即使聯(lián)合其它藥物治療也未能明顯改善患者預(yù)后[8]。因此，探索化療耐藥機制成為骨肉瘤亟需解決的難題。

研究認(rèn)為骨肉瘤對化療耐藥可能與多種因素有關(guān)[2,5]，如ABC轉(zhuǎn)運體表達(dá)增高促進(jìn)藥物外排能力增強、谷胱甘肽/谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶改變藥物代謝對化療藥物的滅活、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變導(dǎo)致抗腫瘤靶點改變等。目前，骨肉瘤化療耐藥的發(fā)生機制仍不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)FoxM1廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織中，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、血管形成、轉(zhuǎn)移和化療耐藥密切相關(guān)[3,9]。我們前期實驗也做了一些相關(guān)分析，如發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞中FoxM1通過上調(diào)DNA損傷修復(fù)蛋白Rad50和Rad51表達(dá)，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的化療耐藥[4,10]。但FoxM1促進(jìn)化療耐藥的分子機制仍然未知，尤其FoxM1與ABC轉(zhuǎn)運體在骨肉瘤化療耐藥中的相關(guān)報道非常有限。

ABC轉(zhuǎn)運體屬于細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，通過細(xì)胞膜泵藥物外排或促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞表達(dá)參與化療耐藥[6,11-12]。ABC轉(zhuǎn)運體家族蛋白表達(dá)增高與骨肉瘤化療耐藥相關(guān)，患者預(yù)后更差[13]。近年研究顯示FoxM1可能調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運體，如在結(jié)直腸癌中FoxM1上調(diào)ABCC10參與對5-氟脲嘧啶的耐藥[14]。ABCA8是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員之一[15]，在卵巢癌中ABCA8的表達(dá)增高與化療耐藥及預(yù)后差密切相關(guān)[7,16]。但FoxM1是否調(diào)控ABCA8，目前尚未見報道。本組發(fā)現(xiàn)在耐藥細(xì)胞MG63/R中FoxM1和ABCA8的表達(dá)均比親本細(xì)胞MG63明顯升高，抑制FoxM1后ABCA8的mRNA和蛋白表達(dá)量也明顯下降，而過表達(dá)FoxM1后ABCA8的表達(dá)也同時上升。此外，聯(lián)合使用FoxM1抑制劑或降低ABCA8的表達(dá)可增強骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。因此，作者推測FoxM1可能通過調(diào)控ABCA8參與骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)FoxM1通過影響細(xì)胞凋亡參與化療耐藥[3]，本組將在后續(xù)實驗中進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)等方法探討FoxM1及ABCA8是否影響細(xì)胞凋亡。

本組為了分析FoxM1和ABCA8的具體作用機制，進(jìn)行了ChIP檢測。ChIP是一種研究蛋白質(zhì)與DNA直接相互作用的方法，并被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子區(qū)特異核苷酸序列結(jié)合方面的研究[17]。本組通過生物信息學(xué)法預(yù)測和ChIP技術(shù)發(fā)現(xiàn)FoxM1在ABCA8啟動子中的結(jié)合位點是-1 383至-1 373區(qū)域中的FHRE區(qū)域富集，具體作用序列是TCTTTTTTATA，表明FoxM1可能通過與啟動子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)ABCA8轉(zhuǎn)錄，但后續(xù)可能需要雙熒光素酶報告基因法進(jìn)一步驗證FoxM1正向調(diào)控ABCA8的表達(dá)。實驗推測FoxM1可能通過調(diào)控ABCA8參與骨肉瘤細(xì)胞化療耐藥，還需積累更多的體內(nèi)外實驗，進(jìn)一步驗證聯(lián)合FoxM1抑制劑或抑制ABCA8是否增加順鉑化療藥物的敏感性。此外，也有研究報道通過ChIP技術(shù)發(fā)現(xiàn)FoxM1與ABCC5啟動子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄參與鼻咽癌細(xì)胞對紫杉醇化療耐藥[18]。

腫瘤細(xì)胞對化療的耐藥性是導(dǎo)致骨肉瘤患者化療失敗的重要原因，分析化療耐藥機制及尋找逆轉(zhuǎn)靶點是現(xiàn)階段骨肉瘤治療的難題。本組發(fā)現(xiàn)FoxM1可能通過調(diào)控ABCA8參與骨肉瘤對順鉑的耐藥，抑制FoxM1或ABCA8的表達(dá)可能成為臨床逆轉(zhuǎn)骨肉瘤對順鉑化療耐藥的新靶點。