張 妍，李 娟，齊麗榮，何洪敏

子宮頸癌是女性常見的三大腫瘤之一。WHO提供的數(shù)據(jù)顯示全球范圍內(nèi)每年可以確診的子宮頸癌病例達50萬，而中國是子宮頸癌高發(fā)國家，每年確診的子宮頸癌患者達13.5萬人，占全球確診人數(shù)的25%。近年來，年輕婦女子宮頸癌的發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。積極探索子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展機制及篩選預(yù)后相關(guān)分子標志物對攻克子宮頸癌具有積極的意義。lncRNA是一類長度大于200 nt的非編碼RNA，廣泛存在于真核細胞，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)lncRNA在各種類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，但lncRNA與子宮頸癌的相關(guān)性研究目前仍處于初始階段。本實驗主要基于腫瘤數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，利用生物信息學分析方法，識別子宮頸癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取及差異lncRNA的篩選子宮頸癌轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)矩陣文件從TCGA數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)直接下載，測序數(shù)據(jù)類型為原始數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)下載后整理出具有完整臨床信息的306例子宮頸癌樣本及3例配對癌旁樣本信息，本實驗數(shù)據(jù)基于數(shù)據(jù)庫不需倫理委員會批準，使用R軟件中的limma包篩選差異的lncRNA。

1.2 生存分析首先利用R軟件進行Kaplan-Meier生存分析和單因素Cox分析，獲取具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的lncRNA，隨后將篩選出的預(yù)后相關(guān)基因進行多因素回歸分析，以風險值=∑(基因系數(shù)×基因表達量)構(gòu)建風險模型，并分析模型的可靠性，最終確定出與子宮頸癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA。

1.3 lncRNA靶基因的確定本實驗采用R軟件中的Cor函數(shù)通過共表達方式進行預(yù)后lncRNA靶基因的篩選。

1.4 lncRNA靶基因功能注釋和通路分析分別加載R軟件包“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”和“ggplot2”進行對lncRNA靶基因的GO和KEGG富集分析，GO與KEGG富集結(jié)果以氣泡圖和列表形式呈現(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計學分析所有統(tǒng)計分析均使用R(v.3.4.3)進行，初步篩選差異lncRNA條件為FDR<0.05且差異倍數(shù)變化>2(|logFC|>1)，生存相關(guān)的預(yù)后分析涉及統(tǒng)計學意義的均選擇P<0.05，在尋找子宮頸癌預(yù)后相關(guān)lncRNA靶基因過程中實驗選用的共表達Pearsson相關(guān)系數(shù)絕對值>0.4且P<0.05，最后在進行GO與KEGG統(tǒng)計學分析過程中FDR<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌與癌旁組織差異lncRNA初步篩選對TCGA數(shù)據(jù)庫中306例子宮頸癌樣本和3例癌旁樣本進行差異分析，以foldchange(差異倍數(shù))絕對值>2倍且FDR值<0.05為界限，初步篩選共發(fā)現(xiàn)差異lncRNA 292個，其中上調(diào)的lncRNA有179個，下調(diào)的lncRNA有113個(圖1)。

圖1 差異lncRNA火山圖：紅色表示上調(diào)的lncRNA,綠色表示下調(diào)的lncRNA

2.2 差異lncRNA預(yù)后相關(guān)分析分別對上述292個差異lncRNA進行Kaplan-Meier生存分析與單因素Cox分析，然后取兩者交集，最終篩選出8個顯著差異的lncRNA，結(jié)果詳見表1和圖2。

圖2 8個顯著差異lncRNA的Kaplan-Meier生存分析及其與單因素Cox分析交集韋恩圖：A～H.lncRNA的Kaplan-Meier生存分析結(jié)果；I.lncRNA的Kaplan-Meier生存分析與單因素Cox分析交集韋恩圖

表1 Kaplan-Meier與單因素Cox生存分析篩選出的8個顯著差異的lncRNA

2.3 構(gòu)建7個lncRNA的多因素Cox模型對上述篩選的8個lncRNA進行多因素Cox分析，構(gòu)建生存模型(圖3A)，模型可靠性采用繪制ROC曲線形式呈現(xiàn)(圖3B)。根據(jù)風險值將樣本分為高風險與低風險兩組，進行生存相關(guān)分析(圖3C)。

圖3 7個lncRNA構(gòu)建的預(yù)后模型：A.7個lncRNA構(gòu)建的預(yù)測模型以森林圖形式呈現(xiàn)，*P<0.05,**P<0.01；B.評估模型可靠性的ROC曲線圖；C.風險值相關(guān)預(yù)后生存分析

2.4 lncRNA靶基因功能注釋利用生物信息學分析方法首先篩選多因素Cox分析構(gòu)建的基因模型中差異有顯著性的4個lncRNA，即LINC00908、LINC01305、CASC15和DLEU1的共表達靶基因，篩選條件為Pearsson相關(guān)系數(shù)絕對值>0.4，且P<0.05，最后篩選出符合條件的編碼基因1 187個，最后對共表達靶基因進行功能注釋，包括GO和KEGG，最顯著富集分析結(jié)果見圖4與表2(只包括GO分析中顯著的生物學過程部分，表3)。

圖4 lncRNA靶基因功能注釋圖：A.靶基因的GO分析結(jié)果；GO包括BP(生物學過程)、CC(細胞成分)和MF(分子功能)三部分，圖中顯示每部分最顯著的前10個分析；B.靶基因KEGG分析結(jié)果，紅色越紅表示顯著性強，藍色顯示結(jié)果相反，黑色圓表示基因集中富集到該功能或者通路上的基因的數(shù)目，數(shù)目越大，表示富集的基因數(shù)目越多

表2 lncRNA靶基因的生物學過程富集

表3 lncRNA靶基因的通路富集

3 討論

TCGA數(shù)據(jù)庫是目前全球范圍內(nèi)最大的腫瘤公共數(shù)據(jù)庫，為當前腫瘤相關(guān)研究提供寶貴的數(shù)據(jù)資源[3]。作者首先根據(jù)基因轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)對子宮頸癌與癌旁組織中的差異lncRNA進行篩選，然后對初步篩選出的全部差異lncRNA進行Kaplan-Meier生存分析和單因素Cox分析，選擇兩種分析結(jié)果差異均具有顯著性的lncRNA基因集，最后共篩選出8個與患者預(yù)后相關(guān)的lncRNA，分別為：DLEU1、LINC00908、LINC00702、LINC01337、CASC15、LINC00484、UNQ6494和LINC01305。隨后采用多因素Cox回歸分析法構(gòu)建與患者預(yù)后相關(guān)的基因模型，結(jié)果顯示構(gòu)建的多基因模型其C統(tǒng)計量為0.7，ROC曲線面積為0.714，根據(jù)構(gòu)建模型的多基因riskscore(riskscore中位值為1.085 6)將樣本分為高風險組和低風險組，結(jié)果顯示差異有顯著性(P=2.834E-06)，說明作者構(gòu)建的基于lncRNA分子預(yù)測模型具有較為良好的效能，可以實現(xiàn)對子宮頸癌患者預(yù)后狀況的有效預(yù)測。

對于模型中7個lncRNA在腫瘤研究領(lǐng)域尤其子宮頸癌相關(guān)的研究情況，LINC00702在腦膠質(zhì)瘤中可以通過激活Wnt/β-catenin通路促進其進展[4]，在非小細胞肺癌中，LINC00702通過調(diào)節(jié)miR-510/pten軸抑制非小細胞肺癌的增殖和侵襲[5]，而其在子宮頸癌中研究還未涉及，模型構(gòu)建結(jié)果提示其可能是子宮頸癌的一個促癌因子。LINC01305可以通過抑制TNXB介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路抑制子宮頸癌細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移[6]。DLEU1作為促癌因子在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中均有參與[7-8]，在子宮頸癌中，研究發(fā)現(xiàn)DLEU1通過與miR-381相互作用促進子宮頸癌中HOXA13的表達，從而促進子宮頸癌的增殖和侵襲[9]。CASC15在腫瘤中研究也較多，在子宮頸癌中發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC15與其腫瘤生長密切相關(guān)，是子宮頸癌預(yù)后較差的診斷因子[10]，這與本實驗結(jié)果一致。目前，LINC00908、LINC01337與LINC00484在腫瘤領(lǐng)域中的相關(guān)研究還未涉及，這為以后相關(guān)研究提供了新的分子靶標。

為實現(xiàn)對子宮頸癌預(yù)后相關(guān)lncRNA功能的解讀，通過對其共表達基因功能的注釋。靶基因的生物學功能注釋結(jié)果顯示，子宮頸癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA生物學過程主要富集細胞膜黏附分子對細胞的黏附作用、膠原原纖維組織、角質(zhì)化、內(nèi)胚層細胞分化等幾個方面，這些生物學過程均參與了子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。在通路方面，其富集的通路主要集中在胞外基質(zhì)受體相互作用、焦點粘連、PI3K/Akt信通路號、蛋白消化與吸收、細胞黏附分子、鈣離子信號通路等腫瘤相關(guān)通路，鑒于本實驗基于生物信息學方法，深層次機制研究還要基于濕實驗進行驗證。

綜上所述，本實驗利用生物信息學的方法分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中子宮頸癌測序數(shù)據(jù)，同時構(gòu)建與子宮頸癌預(yù)后相關(guān)的7個lncRNA基因集模型，并對其功能進行注釋，該實驗豐富了和創(chuàng)新了子宮頸癌lncRNA研究內(nèi)容，也為今后子宮頸癌非編碼RNA的研究提供新思路。