唐 丹，段 怡，周曉青，楊志惠

2018年全球癌癥調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)發(fā)病率位居惡性腫瘤的第3位，病死率已躍居第2位[1-2]。CRC治療通常以化療為主，但化療毒性高，機(jī)體反應(yīng)相對(duì)較低。因此，研發(fā)并探尋新的治療途徑尤為關(guān)鍵[3]。分子靶向治療是干預(yù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中一些關(guān)鍵分子，阻斷信號(hào)通路的傳導(dǎo)，起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并且對(duì)周?chē)＜?xì)胞毒副作用較小。在發(fā)揮抗腫瘤作用方面，由于分子靶向藥物的快速發(fā)展和臨床應(yīng)用，腫瘤的系統(tǒng)性治療已經(jīng)取得重大進(jìn)展[4]。CRC的特征是具有遺傳多樣性，因此從CRC發(fā)病機(jī)制的不同角度探尋新的分子靶點(diǎn)尤為關(guān)鍵。GTP結(jié)合蛋白4(GTP binding protein 4, GTPBP4)基因，即核仁G蛋白(nucleolar G protein, Nog1)、腦紅蛋白(neuroglobin, NGB)、慢性腎功能衰竭基因(chronic renal failure gene-1, CRFG)。GTPBP4基因定位于染色體10p14-p15，編碼的GTPBP4蛋白廣泛表達(dá)于從錐蟲(chóng)到人類(lèi)的真核生物細(xì)胞核，是核仁中重要的功能蛋白[5]。在本課題前期的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沉默GTPBP4基因后，結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO[6]及HT29[7]發(fā)生G0/G1期阻滯，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞增殖受抑。原癌基因c-Jun屬于Jun家族，是激活蛋白-1(activating protein-1, AP-1)的重要組成部分[8]，并且其與眾多腫瘤關(guān)系密切。有研究表明，由LMP1誘導(dǎo)的c-Jun/Jun B異二聚體可以上調(diào)Cyclin D1啟動(dòng)子的活性和表達(dá)，Cyclin D1的過(guò)表達(dá)加速了細(xì)胞周期的進(jìn)展。結(jié)合前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證沉默GTPBP4基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力的影響，并探究其與原癌基因c-Jun之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；shRNA慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司；細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自BD公司；CCK-8試劑購(gòu)自碧云天公司；4～6周齡體重16～18g BALB/c裸鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)SCXK(川)2015-030；兔抗人GTPBP4單克隆抗體、兔抗人Cyclin D1單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；鼠抗人BCL-2單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、c-Jun兔抗人單克隆抗體購(gòu)自CST公司；倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.2 方法

1.2.1穩(wěn)定低表達(dá)GTPBP4細(xì)胞株篩選 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞并以每毫升5×104個(gè)的細(xì)胞密度接種于6孔板中；對(duì)6孔板細(xì)胞進(jìn)行慢病毒感染(MOI=20)；感染72～96 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)。確定細(xì)胞表達(dá)綠色熒光后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含有2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，每3天更換1次含嘌呤霉素的培養(yǎng)基，篩選維持3周左右。qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株GTPBP4基因沉默效率。

1.2.2平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，以每孔200個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，每組種板設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37 ℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3周。培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞集落時(shí)，終止細(xì)胞培養(yǎng)，以4%多聚甲醛溶液固定6孔板中的細(xì)胞15～30 min。500 μL結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15 min，洗去多余染色液，干燥后計(jì)數(shù)拍照?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.3裸鼠皮下結(jié)腸癌移植瘤模型建立 將10只裸鼠隨機(jī)分為兩組后編號(hào)，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。胰酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×107個(gè)，消毒裸鼠右側(cè)腋背部皮膚，按每只裸鼠0.2 mL體積接種，沿皮下斜行進(jìn)針，注射完畢后可見(jiàn)直徑0.5～0.8 cm皮丘形成，表示接種成功。當(dāng)接種部位形成肉眼可見(jiàn)瘤結(jié)節(jié)時(shí)，每間隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體最長(zhǎng)徑(a)及與之垂直的短徑(b)，最終瘤體體積按照公式V=1/2ab2計(jì)算。記錄并分析數(shù)據(jù)。接種4周后采用脫頸椎法處死裸鼠，剝離皮下瘤結(jié)節(jié)，拍照后稱(chēng)量瘤重。瘤組織用10%中性福爾馬林固定，以便行常規(guī)HE及免疫組化染色。

1.2.4Western blot法 RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液后沸水中煮沸5～10 min使蛋白變性。配置10%分離膠及5%濃縮膠，濃縮膠恒壓80 V跑膠30 min，分離膠恒壓110 V跑膠90 min。切下相應(yīng)分子量的膠，以200 mA恒流4 ℃電轉(zhuǎn)30～90 min。5%牛奶封閉液室溫封閉1 h。4 ℃一抗孵育過(guò)夜。次日TBST洗凈多余一抗后，二抗室溫孵育1 h。滴加ECL試劑，于成像儀中曝光成像。Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.2.5免疫組化 實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法檢測(cè)蛋白表達(dá)。4～6 μm厚石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；按照各抗體說(shuō)明書(shū)選擇檸檬酸鹽緩沖液或EDTA進(jìn)行抗原熱修復(fù)；1 ∶100～1 ∶200稀釋一抗，滴加于組織上，室溫孵育4 h；即用型二抗均勻滴加于組織上，室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

2 結(jié)果

2.1 HCT116穩(wěn)定細(xì)胞株沉默效率將嘌呤霉素篩選3周后的實(shí)驗(yàn)組(shGTPBP4)、陰性對(duì)照組(shControl)的兩組細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察，見(jiàn)兩組細(xì)胞均完全表達(dá)GFP綠色熒光蛋白。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞GTPBP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組GTPBP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.074 2±0.004 4，陰性對(duì)照組GTPBP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.003 2±0.099 9，實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定細(xì)胞株GTPBP4蛋白的表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組。由兩組相對(duì)mRNA表達(dá)量計(jì)算得出實(shí)驗(yàn)組GTPBP4基因沉默效率為92.60%。

圖1 HCT116穩(wěn)定細(xì)胞株沉默效率檢測(cè)：A.qRT-PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞mRNA相對(duì)表達(dá)量，**P<0.01；B.Western blot法檢測(cè)兩組細(xì)胞GTPBP4蛋白表達(dá)

2.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)將兩組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株接種于96孔板中檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)450 nm處OD值，接種24、48、72、96 h的陰性對(duì)照組OD值分別為0.764 1±0.021 9、1.470 1±0.148 4、2.221 5±0.146 9、3.127 4±0.020 6，實(shí)驗(yàn)組OD值分別為0.536 6±0.029 8、0.899 9±0.023 3、1.152 7±0.050 8、1.687 8±0.341 0，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組OD值均低于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001，表1，圖2)。并由此可計(jì)算實(shí)驗(yàn)組24、48、72、96 h的細(xì)胞增殖平均抑制率分別為29.77%、38.79%、48.11%、46.03%。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的OD值

圖2 CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的增殖曲線

2.3 沉默GTPBP4基因?qū)CT116細(xì)胞克隆形成能力的影響在細(xì)胞平板集落形成實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組細(xì)胞集落形成數(shù)目為(127.00±12.49)個(gè)，克隆形成率為63.5%；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落數(shù)目為(15.33±5.51)個(gè)，克隆形成率為7.67%，兩組相比，實(shí)驗(yàn)組克隆形成率明顯降低，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3 陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落形成

2.4 沉默GTPBP4基因?qū)CT116細(xì)胞裸鼠成瘤能力的影響

2.4.1裸鼠移植瘤瘤體體積生長(zhǎng)曲線 接種6天后可見(jiàn)皮下結(jié)節(jié)形成，隨著結(jié)節(jié)的增長(zhǎng)，兩組裸鼠平均體重減少，消瘦明顯，陰性對(duì)照組瘤結(jié)節(jié)最大者于第23天死亡，剩余4只；實(shí)驗(yàn)組裸鼠消瘦明顯，5只全部存活。每間隔3天測(cè)量記錄并計(jì)算瘤體體積，繪制生長(zhǎng)曲線(圖4)，結(jié)果顯示，于第6天至第26天合計(jì)6次測(cè)量?jī)山M瘤體體積，自測(cè)量第10天起實(shí)驗(yàn)組皮下瘤體體積均較陰性對(duì)照組小，兩組相比差異有顯著性(P均<0.05)，且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組瘤體積較陰性對(duì)照組減小更為明顯。

圖4 陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞裸鼠瘤體體積生長(zhǎng)曲線

2.4.2裸鼠移植瘤瘤體質(zhì)量 接種細(xì)胞后的第28天用脫頸椎法處死裸鼠，剝離皮下瘤結(jié)節(jié)，微量電子稱(chēng)進(jìn)行瘤體稱(chēng)重，實(shí)驗(yàn)組平均瘤體質(zhì)量為(0.094 2±0.044 5)g，陰性對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量為(0.694 0±0.149 5)g，實(shí)驗(yàn)組瘤體質(zhì)量明顯小于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)。此結(jié)果表明沉默GTPBP4基因能顯著抑制HCT116細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力。

圖5 兩組細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤對(duì)比：A.陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組移植瘤剝離前對(duì)比；B.兩組移植瘤剝離后對(duì)比

2.5 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞及裸鼠瘤體組織中蛋白的表達(dá)Western blot法檢測(cè)陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及裸鼠移植瘤瘤體各蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及瘤體組織中的GTPBP4蛋白表達(dá)均明顯降低，說(shuō)明在裸鼠成瘤過(guò)程中HCT116細(xì)胞穩(wěn)定低表達(dá)GTPBP4基因，在此基礎(chǔ)上細(xì)胞及瘤體組織中c-Jun、Cyclin D1、BCL-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高(圖6)。

圖6 Western blot法檢測(cè)兩組細(xì)胞及瘤體組織中GTPBP4、c-Jun、Cyclin D1、BCL-2和Bax蛋白表達(dá)水平：A.細(xì)胞及組織各蛋白條帶圖；B.各蛋白灰度值分析柱形圖，**P<0.01

2.6 免疫表型瘤體組織免疫組化結(jié)果顯示，GTPBP4、c-Jun、Ki-67及Cyclin D1表達(dá)均定位于細(xì)胞核，BCL-2、Bax表達(dá)定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)(圖7)。陰性對(duì)照組GTPBP4、c-Jun、BCL-2、Ki-67及Cyclin D1染色呈棕黃色顆粒，且分布廣泛，呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性；實(shí)驗(yàn)組瘤體GTPBP4、c-Jun、BCL-2、Ki-67及Cyclin D1染色均較淺，呈散在弱陽(yáng)性，表達(dá)明顯較陰性對(duì)照組低；而B(niǎo)ax表達(dá)在陰性對(duì)照組中較實(shí)驗(yàn)組弱。免疫組化染色結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致。Ki-67主要反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，Ki-67在陰性對(duì)照組中的表達(dá)較強(qiáng)，間接表明陰性對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng)。

圖7 瘤體組織中各蛋白的表達(dá)：GTPBP4、c-Jun表達(dá)定位于細(xì)胞核，BCL-2、Bax表達(dá)定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，EnVision法

3 討論

從GTPBP4基因在腫瘤中的研究現(xiàn)狀來(lái)看，Liu等[9]發(fā)現(xiàn)敲低GTPBP4基因在肝癌中的表達(dá)，能降低肝癌細(xì)胞增殖能力及裸鼠成瘤能力，這與本課題在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的研究結(jié)果相符，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)基因芯片和通路富集分析，有學(xué)者認(rèn)為ERBB信號(hào)通路可能是該基因重點(diǎn)作用的通路之一。在胃癌中的研究表明，GTPBP4基因在癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，GTPBP4的穩(wěn)定敲除抑制了細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；從機(jī)制上講，GTPBP4與p53的相互作用使p53及其相關(guān)信號(hào)通路在GTPBP4穩(wěn)定敲減情況下被激活[10]。此外，高表達(dá)GTPBP4的結(jié)腸癌患者預(yù)后較差，GTPBP4通過(guò)抑制RhoA的活性，特異性地誘導(dǎo)絲狀肌動(dòng)蛋白重排，促進(jìn)晚期結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[11]。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默GTPBP4基因后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，體內(nèi)外成瘤能力明顯減弱。腫瘤Ki-67增殖指數(shù)在裸鼠移植瘤中的表達(dá)也明顯降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GTPBP4表達(dá)下調(diào)后，原癌基因c-Jun在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的蛋白水平表達(dá)隨之下調(diào)，并且在裸鼠移植瘤中檢測(cè)到的c-Jun蛋白表達(dá)也有所降低。由此推測(cè)GTPBP4基因與c-Jun基因在結(jié)腸癌的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中存在某種聯(lián)系。

AP-1是由Fos、Atf、Jun和MAF家族亞單位蛋白組成的二聚體轉(zhuǎn)錄因子，作為致癌轉(zhuǎn)化的介質(zhì)因子[12]，AP-1參與包括炎癥、分化、細(xì)胞遷移、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和傷口愈合在內(nèi)的一系列生物學(xué)過(guò)程[13]。Jun家族蛋白成員包括c-Jun、Jun B和Jun D，c-Jun由核內(nèi)原癌基因c-Jun編碼，具有正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用[14]。實(shí)驗(yàn)中GTPBP4表達(dá)下調(diào)后，c-Jun蛋白及Cyclin D1的表達(dá)同時(shí)下調(diào)，可能是由于c-Jun作為上游調(diào)控基因，通過(guò)抑制p53腫瘤抑制劑和促進(jìn)細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)調(diào)節(jié)增殖進(jìn)程[15]。這在一定程度上可以解釋GTPBP4下調(diào)后引起Cyclin D1表達(dá)降低的原因。

在調(diào)控凋亡發(fā)生方面，有研究報(bào)道BCL-2與c-Jun、c-Fos在胃癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，并且晚期癌癥中的表達(dá)水平更高，三者共同作用介導(dǎo)胃癌的發(fā)展[16]。c-Jun是c-Jun N末端激酶(JNK)的下游靶效應(yīng)分子，β-半乳糖苷結(jié)合蛋白(gal-1)通過(guò)JNK/c-Jun/AP-1途徑對(duì)T細(xì)胞死亡起一定的調(diào)控作用[17]。c-Jun N末端激酶JNK1/2/3-、p38-和ERK1/2-MAPK/c-Jun級(jí)聯(lián)信號(hào)通路可能有助于上調(diào)胃癌細(xì)胞中BARF1誘導(dǎo)的抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-xL的表達(dá)，這有利于胃癌的發(fā)展[18]。Schwarz等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白BCL-2 ERK途徑以時(shí)間和濃度依賴(lài)性方式導(dǎo)致c-Jun在SER73位點(diǎn)磷酸化，以促進(jìn)更好發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)探討了下調(diào)GTPBP4基因的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)及體外細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明GTPBP4基因在結(jié)腸癌中主要是發(fā)揮癌基因的功能，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與發(fā)展?？赡苁峭ㄟ^(guò)調(diào)控c-Jun、Cyclin D1、BCL-2/Bax的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GTPBP4基因在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為該基因成為分子治療靶標(biāo)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。