蔣雨薇，宋海燕,2，李怡萍，湯凱悅，徐嬌雅，SULAIMAN Andrew，MCGARRY Sarah，WANG Lisheng，鄭培永,2

原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示我國(guó)肝癌發(fā)病率及病死率均較高，發(fā)病率位居惡性腫瘤的第3位[1]。肝癌具有惡性程度高、病情進(jìn)展迅速等特點(diǎn)。目前仍然缺乏有效的治療藥物，大部分患者預(yù)后差[2]。建立恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型是研究肝癌治療方法的基礎(chǔ)和前提[3]。水動(dòng)力尾靜脈注射(hydrodynamic tail vein injection, HTVi)聯(lián)合Sleeping Beauty(SB)質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子可介導(dǎo)一種或幾種促癌基因整合到肝細(xì)胞中，肝細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)促癌基因從而形成肝癌。既往研究顯示蛋白激酶B(protein Kinase B, PKB)或Akt、β-catenin、轉(zhuǎn)錄共激活因子相關(guān)蛋白(yes-associated protein, Yap)在肝癌組織中表達(dá)顯著增加，是肝癌促癌基因[4-6]。本文通過(guò)給予C57BL/6J小鼠尾靜脈水動(dòng)力高壓注射SB質(zhì)粒及Akt/β-catenin/Yap促癌基因質(zhì)粒的方法構(gòu)建肝癌動(dòng)物模型，為肝癌研究提供了新的有價(jià)值的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J小鼠，SPF級(jí)，6周齡，雄性，共10只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005。小鼠飼養(yǎng)于室溫(22±3)℃、相對(duì)濕度50%～70%的環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)步驟由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南。

1.2 試劑與藥物L(fēng)B培養(yǎng)基預(yù)混粉末、LB肉湯瓊脂培養(yǎng)基預(yù)混粉末購(gòu)于碧云天生物公司。DH-5α感受肽菌購(gòu)于天根生化公司。質(zhì)粒大量抽提試劑盒為Promega產(chǎn)品。質(zhì)粒PT2/C-Luc/PGK-SB13、pT3-myr-AKT-HA、pT3-EF1aH N90-β-catenin、pT-3EF1a-Yap S127A均從Addgene公司獲得，其中PT2/C-Luc/PGK-SB13由John Ohlfest贈(zèng)予(Addgene plasmid #20207；http://n2t.net/addgene:20207；RRID：Addgene_20207)[7]，pT3-myr-AKT-HA由Xin Chen贈(zèng)予(Addgene plasmid #31789；http://n2t.net/addgene:31789；RRID：Addgene_31789)[8]，pT3-EF1aH N90-β-catenin由Xin Chen贈(zèng)予(Addgene plasmid # 86499；http://n2t.net/addgene:86499；RRID: Addgene_86499)[9]，pT-3EF1a-Yap S127A由Xin Chen贈(zèng)予(Addgene plasmid#46049；http://n2t.net/addgene:46049；RRID: Addgene_46049)[10]。Akt、β-catenin、Yap、二抗(抗兔)抗體購(gòu)于Cell Signaling公司。PVDF膜(0.22、0.45 μm)、ECL化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于Millipore公司。RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)于碧云天生物公司。10%丙烯酰胺購(gòu)于BIO-RAD公司。麗春紅染色試劑購(gòu)于康為世紀(jì)公司。蘇木精染色劑、中性樹膠購(gòu)于上海億欣生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1質(zhì)粒擴(kuò)增抽提 將含有PT2/C-Luc/PGK-SB13、pT3-myr-AKT-HA、pT3-EF1aH N90-β-catenin、pT-3EF1a-Yap S127A質(zhì)粒導(dǎo)入DH-5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后挑選適合的菌落放到大腸桿菌培養(yǎng)液中，在震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)繁殖，使用Promega質(zhì)粒大提試劑盒抽提純化，檢測(cè)濃度備用。

1.3.2小鼠HTVi質(zhì)粒造模 尾靜脈高壓注射方法參照文獻(xiàn)[11]所述，將質(zhì)粒混合于2 mL PBS中配置成溶液，在10 s內(nèi)通過(guò)尾靜脈注射的方式注射至小鼠體內(nèi)。10只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=5)，模型組(n=5)。模型組尾靜脈快速注射含有15 μg PT-3EF1a-Yap S127A、15 μg pT3-EF1aH N90-β-catenin、15 μg pT3-myr-AKT-HA和5 μg PT2/C-Luc/PGK-SB13的質(zhì)?；旌先芤? mL，對(duì)照組給予等量PBS。8周后小鼠麻醉處死，取肝臟組織凍存或多聚甲醛固定備用。

1.3.3小鼠活動(dòng)、體重、肝重與肝體比 觀察記錄小鼠活動(dòng)情況，測(cè)量體重、肝重，計(jì)算肝體比。

1.3.4病理學(xué)檢查 觀察小鼠肝臟形態(tài)。肝組織用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行脫水和石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察小鼠肝組織病理學(xué)變化。

1.3.5Western blot法 肝組織用RIPA裂解液勻漿提取蛋白，以12 000 r/min離心后收集上清液。細(xì)胞裂解物在10%丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉1 h，分別孵育Akt、Yap、β-catenin抗體4 ℃過(guò)夜，將膜在TBST溶液洗滌3次后室溫孵育二抗，將膜洗滌3次并通過(guò)ECL發(fā)光底物曝光顯影，將PVDF膜上全蛋白以麗春紅染色作為上樣量參照。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重、肝重與肝體比變化實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組小鼠活動(dòng)度好，飲食正常，皮毛光亮；尾靜脈注射4周后，模型組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)度差，精神萎靡，活動(dòng)減少，皮毛顏色發(fā)黃雜亂，并逐漸加重。1只模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)第55天死亡。與對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠體重下降，肝重和肝體比顯著增加(圖1)。

圖1 各組小鼠體重(A)、肝重(B)、肝體比(C)變化與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2 小鼠肝臟形態(tài)學(xué)變化對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，形態(tài)正常。模型組小鼠肝臟體積明顯增大，質(zhì)地較硬，肝臟表面出現(xiàn)大量顆粒狀、結(jié)節(jié)樣改變(圖2)。

AB

鏡下觀察對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉肝細(xì)胞分界清晰。模型組肝索排列紊亂，出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，伴隨肝細(xì)胞脂肪變性，炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。

100×400×對(duì)照組模型組

2.3 Western blot法檢測(cè)小鼠肝組織中Akt、Yap、β-catenin蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)以麗春紅染色(ponceau S)總蛋白灰度作為上樣量參照，結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組相比，Akt、Yap、β-catenin蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(圖4)，提示轉(zhuǎn)染的促癌基因在模型小鼠體內(nèi)成功過(guò)表達(dá)。

圖4 小鼠肝組織中Akt、β-catenin、Yap蛋白的表達(dá)：A.Western blot條帶：1、3、5為對(duì)照組；2、4、6為模型組；B.蛋白表達(dá)相對(duì)值，與對(duì)照組相比，*P<0.05

3 討論

目前幾種常見的肝癌動(dòng)物模型包括：誘導(dǎo)型模型通過(guò)亞硝胺類、黃曲霉素B1等化學(xué)藥物誘導(dǎo)建立肝癌模型[12]，此類動(dòng)物模型成功率高，但存在造模時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1年、造模病死率高等缺點(diǎn)。移植模型是將人源或動(dòng)物源的肝癌細(xì)胞株或者腫瘤組織塊種植到動(dòng)物體內(nèi)，包括皮下移植瘤模型、原位移植瘤模型[13-14]，目前應(yīng)用較廣。皮下瘤易于觀察但不能模擬臨床腫瘤生長(zhǎng)的環(huán)境，原位種植瘤可一定程度反映腫瘤與微環(huán)境的作用及觀察轉(zhuǎn)移，但種植過(guò)程繁瑣、技術(shù)要求高，另外種植模型多采用免疫缺陷鼠，不適合設(shè)計(jì)免疫系統(tǒng)的研究。轉(zhuǎn)基因肝癌模型是通過(guò)基因工程的方法將特定的促癌基因?qū)?抑癌基因敲除，如建立肝炎病毒轉(zhuǎn)基因模型、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1基因敲除模型，能夠模擬臨床腫瘤發(fā)展的過(guò)程。但生殖細(xì)胞基因修飾的小鼠成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，需要較高專業(yè)水平，胚胎病死率高，且比較適用于特定基因?qū)τ谀[瘤的影響，如要研究多個(gè)基因?qū)Ω伟┑淖饔眯枰浅?fù)雜的小鼠雜交完成[15-16]。

本組實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的肝癌造模方法需要三種要素：HTVi促進(jìn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基因整合、兩側(cè)帶有反向重復(fù)序列及啟動(dòng)子的癌基因質(zhì)粒。

HTVi是將大體積的質(zhì)粒DNA溶液通過(guò)尾靜脈快速注射到小鼠體內(nèi)，高壓情況下肝內(nèi)皮細(xì)胞窗孔增大、肝細(xì)胞膜產(chǎn)生孔隙，特定的質(zhì)粒DNA就能夠通過(guò)孔隙進(jìn)入肝細(xì)胞中[17]；也有研究認(rèn)為大體積質(zhì)粒DNA溶液經(jīng)尾靜脈快速注射會(huì)使小鼠出現(xiàn)短暫心衰，溶液經(jīng)下腔靜脈返流進(jìn)入肝臟的同時(shí)血液在肝血竇中無(wú)法回流，質(zhì)粒在肝臟中長(zhǎng)時(shí)間停留最終被肝臟攝取[18]，10%～40%肝細(xì)胞可被轉(zhuǎn)染。該技術(shù)可造成暫時(shí)性肝損傷，一般在1周內(nèi)恢復(fù)正常。轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的DNA在8～24 h后開始迅速降解，SB轉(zhuǎn)座子可將目的基因通過(guò)剪切插入整合至宿主基因，從而可穩(wěn)定表達(dá)癌基因。該技術(shù)可達(dá)到2%～10%肝細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)癌基因，最終誘導(dǎo)肝癌生成。根據(jù)轉(zhuǎn)染癌基因的種類和個(gè)數(shù)不同，一般可在1周至數(shù)月形成肝癌。

Akt、β-catenin、Yap是肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)鍵基因。Akt作為一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，其磷酸化即活化形式能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡等過(guò)程[19]。在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，β-catenin活化入核能夠促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖的靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[20]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)Yap通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性作用，成為肝癌形成的一條重要傳導(dǎo)通路[21]。Akt、β-catenin、Yap三種基因能夠通過(guò)不同信號(hào)通路，互相影響、調(diào)控，促進(jìn)肝癌的形成。

本組實(shí)驗(yàn)采取尾靜脈高壓注射SB質(zhì)粒及Akt/β-catenin/Yap質(zhì)粒的方法進(jìn)行肝癌造模。8周后病理檢查結(jié)果顯示，模型組肝臟增大出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，表明模型組均形成肝癌。肝癌形成導(dǎo)致小鼠體重下降、精神和活動(dòng)差，并導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)束前有1只小鼠死亡。模型鼠肝組織Akt、β-catenin、Yap基因出現(xiàn)顯著高表達(dá)，提示這些癌基因?qū)е赂渭?xì)胞的癌變及增殖形成肝癌。既往有研究應(yīng)用該技術(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)染Akt需要28周形成肝癌，Akt/Yap聯(lián)合轉(zhuǎn)染約6周[22]，而Akt/β-catenin聯(lián)合轉(zhuǎn)染約需4周[23]。本組應(yīng)用Akt/β-catenin/Yap三種促癌基因誘導(dǎo)，以保障模型成功率，在8周時(shí)觀察到肝癌已達(dá)嚴(yán)重程度并導(dǎo)致1只小鼠死亡，說(shuō)明肝癌誘導(dǎo)成功的時(shí)間點(diǎn)較早，但具體時(shí)間需要后續(xù)動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)再明確。國(guó)外多采用FVB/N小鼠運(yùn)用該技術(shù)造模，但這種小鼠在國(guó)內(nèi)飼養(yǎng)較少且價(jià)格較高，本組采用常規(guī)價(jià)廉的C57BL/6J小鼠，證實(shí)應(yīng)用HTVi SB和癌基因質(zhì)粒建立肝癌模型在C57BL/6J小鼠也較容易實(shí)現(xiàn)。

尾靜脈高壓注射質(zhì)粒建立肝癌模型具有明顯的優(yōu)勢(shì)：注射的特定癌基因相關(guān)質(zhì)粒能夠在肝臟中高效表達(dá)，可占正常肝細(xì)胞的2%～10%；注射通常在6～8周齡的小鼠中進(jìn)行，不會(huì)對(duì)小鼠的胚胎發(fā)育產(chǎn)生任何影響，相比于轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠更加經(jīng)濟(jì)，且可顯著減少實(shí)驗(yàn)所需的小鼠數(shù)量；尾靜脈高壓注射能夠應(yīng)用于不同遺傳背景的小鼠，尤其是可用于非免疫缺陷小鼠，能夠應(yīng)用于信號(hào)通路、細(xì)胞表型及評(píng)估藥物反應(yīng)性等多種研究[24]。這項(xiàng)技術(shù)也存在一定不足：通過(guò)水動(dòng)力轉(zhuǎn)染成瘤的肝臟病變面積相對(duì)于一般人肝腫瘤來(lái)說(shuō)太大，小鼠肝臟出現(xiàn)大量結(jié)節(jié)無(wú)法計(jì)數(shù)；大多數(shù)人肝癌組織有肝纖維化或肝硬化的背景，而水動(dòng)力注射只是將特定的基因傳遞到正常肝臟中，缺少腫瘤進(jìn)展的相關(guān)環(huán)境。若需要研究特定致癌基因在腫瘤進(jìn)展中的作用，可考慮運(yùn)用聯(lián)合造模的方式，如在應(yīng)用四氯化碳或高脂高糖飲食誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上進(jìn)行質(zhì)粒注射轉(zhuǎn)染[25]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用HTVi SB質(zhì)粒及Akt/β-catenin/Yap癌基因質(zhì)粒的方法成功建立了小鼠肝癌模型，該模型對(duì)于研究促癌/抑癌基因單獨(dú)或聯(lián)合在肝癌發(fā)生中的作用尤其適用，因適用于非免疫缺陷型動(dòng)物所以可應(yīng)用于免疫、炎癥等相關(guān)的肝癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和治療研究，另外將來(lái)可進(jìn)一步聯(lián)合其它動(dòng)物造模方法研究基礎(chǔ)疾病誘導(dǎo)的肝癌模型，如脂肪肝/代謝-肝癌、肝硬化-肝癌等。該方法經(jīng)濟(jì)便捷、病死率低、成功率高且發(fā)病機(jī)制與臨床疾病相符，是一種可供今后科研和臨床藥物研究使用的肝癌動(dòng)物模型。