左麗麗，高永欣，王鈺涓，王舒然，富校軼

(吉林醫(yī)藥學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013)

豆醬是我國古老且具有特色的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，距今已經(jīng)有數(shù)千年的發(fā)展歷史。傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的制作方法是以黃豆為主要的原材料，首先經(jīng)過煮制，然后擠壓成塊，再通過制曲以及發(fā)酵等一系列的工藝加工而成的半流動(dòng)態(tài)食品[1]。在傳統(tǒng)豆醬的制曲以及豆醬的發(fā)酵過程中，利用原材料以及周圍環(huán)境中存在的各種微生物通過自然發(fā)酵，微生物將原材料中的大分子物質(zhì)例如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等進(jìn)行分解，得到小分子的酸、醛、酮和酯等一系列風(fēng)味物質(zhì)，從而使傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的pH值以及各種營養(yǎng)成分等發(fā)生一系列的變化[2,3]。發(fā)酵豆醬中因?yàn)楹胸S富的營養(yǎng)成分、濃郁的香氣和色澤以及獨(dú)特的味道，深受全國各地居民的喜愛。同時(shí)發(fā)酵豆醬中還蘊(yùn)藏著豐富的且有益于機(jī)體健康的微生物資源，例如乳酸菌、酵母菌等。大量研究成果表明，乳酸菌在豆醬的自然發(fā)酵過程中發(fā)揮非常重要的作用，能夠直接影響豆醬的色、香、味等，是與其風(fēng)味的形成關(guān)系最為密切的細(xì)菌[4,5]。目前，國內(nèi)外專家以及學(xué)者對(duì)各種各樣發(fā)酵食品中存在的不同乳酸菌進(jìn)行了大量的研究工作，然而，對(duì)吉林地區(qū)農(nóng)家傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中天然存在的乳酸菌種類及其分布的研究甚少。

因此，本文以吉林市農(nóng)家傳統(tǒng)發(fā)酵大醬為試材，在豆醬自然發(fā)酵過程中，采用傾注法對(duì)不同發(fā)酵周期的豆醬進(jìn)行乳酸菌疑似菌株的分離和純化，通過生理學(xué)鑒定，并對(duì)不同周期分離出的乳酸菌提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過測序分析不同發(fā)酵周期大醬中乳酸菌的種類，為進(jìn)一步研究、開發(fā)利用東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中豐富多樣的乳酸菌資源，改善豆醬的風(fēng)味和品質(zhì)，同時(shí)擴(kuò)大工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

農(nóng)家大醬：采用東北傳統(tǒng)方法自制發(fā)酵而成，分別在發(fā)酵后1～10周每周取樣一次，共采集10次，樣品采集方式為隨機(jī)采樣。樣品采集后，將其分裝到10 mL滅菌離心管中，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基與試劑的配制

MRS培養(yǎng)基配方：葡萄糖20.0 g/L，牛肉浸膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，瓊脂18 g，臨用前添加2% CaCO3，于121 ℃高壓滅菌20 min。

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(50次)，采購于生工生物工程(上海)股份有限公司；細(xì)菌通用引物27f和1495r(引物序列：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1495r：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2×Taq PCR Master Mix試劑(試劑中含有染料)，購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

GI54DWS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司；明澈D24UV超純水處理系統(tǒng) Millipore(密理博)公司；HZL-F100恒溫恒濕振蕩培養(yǎng)箱 太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5430R型高速冷凍離心機(jī)、6331 PCR儀 德國Eppendorf公司；FE20K pH計(jì) Mettler-Toledo公司；1645050電泳儀、ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司；JNOEC XS-212-201生物顯微鏡 日本Olympus工業(yè)有限公司。

1.4 樣品的采集

在傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過程中，從發(fā)酵的1～10周每周定時(shí)采集不同時(shí)期的豆醬樣品各50 g，將其分裝于10 mL滅菌離心管中，同時(shí)記錄發(fā)酵過程以及時(shí)間等相關(guān)信息，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存至-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.5 乳酸菌的分離純化

采用傾注培養(yǎng)法同時(shí)結(jié)合劃線分離的方法，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中的乳酸菌進(jìn)行分離和純化。分別稱取1～10周各個(gè)采樣階段的豆醬樣品1 g，用滅菌的生理鹽水進(jìn)行10倍、100倍梯度稀釋后，分別吸取10-1～10-2的樣品稀釋液各20 μL于培養(yǎng)皿中，將121 ℃ 20 min滅菌的MRS培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃之間，向其中加入2 mL制霉菌素溶液，使培養(yǎng)基中制霉菌素的質(zhì)量濃度達(dá)到90 μg/mL，目的是防止霉菌和酵母菌的生長和繁殖。然后將MRS培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，與豆醬樣品稀釋液混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，將其倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h[6-8]。

1.6 乳酸菌的形態(tài)觀察以及生理學(xué)鑒定

觀察平板內(nèi)細(xì)菌的生長情況，挑取有溶鈣圈并且直徑在1～2 mm的單菌落，反復(fù)劃線分離，純化至單菌落為止。

將分離得到的產(chǎn)酸菌進(jìn)行過氧化氫實(shí)驗(yàn)，并將過氧化氫酶結(jié)果呈陰性的菌株逐一進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。同時(shí)觀察MRS培養(yǎng)基平板上所分離得到的乳酸菌菌落形態(tài)、大小、光澤、邊緣形狀以及菌落顏色等一系列特征。并將分離得到的乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色，放置在100倍油鏡下進(jìn)行菌體形態(tài)學(xué)觀察[9]，拍照并記錄乳酸菌菌落形態(tài)和大小等結(jié)果。

1.7 乳酸菌總DNA的提取以及純度的檢測

將篩選出的1～10周的乳酸菌單個(gè)菌落分別接種至含有50 mL MRS的液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下，150 r/min搖床中培養(yǎng)過夜。按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取其中的乳酸菌總DNA。使用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)檢測基因組OD260 nm/OD280 nm的比值以及DNA的濃度，然后再次通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.8 16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增

25 μL PCR反應(yīng)體系：模板1 μL、上下游引物(細(xì)菌16S rDNA通用引物27f和1495r)各1 μL(10 pmol/μL)，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，使用超純水補(bǔ)齊到25 μL。其PCR的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，設(shè)置30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min[10-12]，最后4 ℃保溫。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的擴(kuò)增結(jié)果，將膠板放置在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，同時(shí)檢測是否含有約1500 bp的熒光條帶。將最終的PCR結(jié)果呈現(xiàn)陽性的擴(kuò)增產(chǎn)物寄送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行分析測序。

1.9 乳酸菌16S rDNA同源性分析及其種屬的鑒定

登錄NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)網(wǎng)站，對(duì)PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析和比對(duì)，從數(shù)據(jù)庫中獲得相關(guān)種屬的細(xì)菌16S rDNA序列信息[13,14]。以16S rDNA的序列同源性大于99%以上作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類，然后對(duì)乳酸菌待測菌株以及相關(guān)的模式菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析，并應(yīng)用軟件Mega 7.0中的Neighbor-Joining法對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行構(gòu)建，進(jìn)一步進(jìn)行種屬的鑒定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品中乳酸菌的分離結(jié)果

從不同發(fā)酵時(shí)期的豆醬樣品中分離出革蘭氏陽性疑似菌株共10株，經(jīng)過氧化氫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)全部為陰性菌株，在含有2 g/dL CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上，菌株的菌落形態(tài)全部呈現(xiàn)為乳白色，觀察其邊緣比較規(guī)則，顯示為圓形菌落，菌落直徑大小在1.0～1.5 mm范圍之內(nèi)，通過觀察菌落表面的情況，發(fā)現(xiàn)有的菌落相對(duì)光滑，而部分菌落表面呈現(xiàn)粗糙狀態(tài)，并將其分別命名為SBP1-1、SBP1-2、SBP1-3、SBP1-4、SBP1-5、SBP1-6、SBP1-7、SBP1-8、SBP1-9、SBP1-10。同時(shí)對(duì)分離獲得的10株疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，并在100倍油鏡下觀察菌體的特征。鏡檢結(jié)果表明，所分析的菌株均表現(xiàn)為革蘭氏陽性菌株，其菌體形態(tài)全部呈現(xiàn)為圓球狀，排列方式多種多樣，表現(xiàn)為單個(gè)、短鏈以及成對(duì)等多種方式。部分乳酸菌疑似菌株的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果見圖1，其形態(tài)學(xué)特征見表1。

圖1 部分乳酸菌疑似菌株的革蘭氏染色結(jié)果圖(×100)

表1 分離獲得的各乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征

2.2 乳酸菌總DNA的提取以及16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果檢測

按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取分離純化的乳酸菌總DNA，采用微量紫外-可見分光光度計(jì)檢測分離得到的10株乳酸菌疑似菌株DNA的濃度和純度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所檢測菌株的DNA質(zhì)量濃度全部在200 ng/μL左右，且OD260 nm/OD280 nm的比值基本處于1.6～1.8之間，基本符合PCR擴(kuò)增體系的要求，可以繼續(xù)進(jìn)行下一步的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

將大醬中不同發(fā)酵時(shí)期分離出的乳酸菌16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2，可以觀察到在1～10周的大醬發(fā)酵過程中全部泳道在1500 bp左右的位置都出現(xiàn)了一條亮帶，且在其他位置都沒有出現(xiàn)明顯的非特異性擴(kuò)增條帶，完全符合序列測定要求。將PCR擴(kuò)增片段大小在1500 bp左右的陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定及分析。

圖2 乳酸菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 乳酸菌16S rDNA同源性的分析及其相關(guān)種屬鑒定

登錄NCBI(The National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站，將分離獲得的乳酸菌16S rDNA/rRNA測序結(jié)果與該網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中相關(guān)信息進(jìn)行BLAST同源性分析和比對(duì)。發(fā)酵豆醬中分離純化得到的10株乳酸菌16S rDNA序列同源性比對(duì)的相關(guān)結(jié)果見表2。

表2 吉林市農(nóng)家傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離的乳酸菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果

由表2可知，分離得到的SBP1-1等6株菌與Pediococcuspentosaceus的相似性達(dá)到100%或99%，因此將其鑒定為戊糖片球菌(P.pentosaceus)；篩選出的SBP1-7等3株菌與Enterococcusfaecium的相似性達(dá)到99%，因此將其鑒定為屎腸球菌(E.faecium)；分離獲得的SBP1-9菌株與Enterococcuslactobacillus的相似性達(dá)到100%，所以將其鑒定為乳酸腸球菌(E.lactobacillus)。

2.4 不同時(shí)期傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

登錄NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)網(wǎng)站，從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中獲取信息進(jìn)行同源性分析，從中提取相似度在99%以上的乳酸菌相關(guān)模式菌株的序列，在傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離鑒定的3種乳酸菌中分別各選取1株作為代表菌株，通過Mega 7.0進(jìn)化樹軟件并采用其中的Neighbor-Joining(NJ)法將測序獲得的乳酸菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中模式菌株16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)和分析，同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得發(fā)酵豆醬中乳酸菌目的菌株的分類地位以及它的系統(tǒng)發(fā)育地位。通過軟件獲得系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果見圖3，由其結(jié)果可以看出，SBP1-1、SBP1-7、SBP1-9與相對(duì)應(yīng)的參考菌株同源性較高，都達(dá)到99%以上，并與其聚在一起，從而有效地證明傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中乳酸菌16S rDNA區(qū)域序列分析比對(duì)的結(jié)果有較好的準(zhǔn)確性。

圖3 吉林市傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬分離鑒定的乳酸菌16S rDNA序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究從吉林市農(nóng)家自制大醬的不同發(fā)酵階段采集的10份樣品中，共分離獲得10株乳酸菌，通過16S rDNA序列分析法對(duì)分離得到的乳酸菌進(jìn)行分析和鑒定，其鑒定結(jié)果分別為戊糖片球菌(P.pentosaceus)6株、屎腸球菌(E.lactobacillus)3株，乳酸腸球菌(E.lactis)1株?？梢猿醪酵茢喑鑫焯瞧蚓羌质修r(nóng)家自制豆醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌群，對(duì)傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用。