萬璐，閆佳佳，許哲祥，姜碩，鄭春英*

(1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

作為常用益生菌之一，枯草芽孢桿菌廣泛存在于自然界中[1]，屬于革蘭氏陽性非致病菌[2]，既不引起人和動(dòng)物產(chǎn)生疾病，也不污染環(huán)境[3]，還能產(chǎn)生多種抗生素及廣譜抗菌活性的抑制性酶[4]，同時(shí)，枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗逆性，能夠耐受機(jī)體、生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存等過程中遇到的各種不良環(huán)境條件的變化[5]，在藥品生產(chǎn)、食品發(fā)酵、調(diào)味品等方面被廣泛應(yīng)用[6-8]，產(chǎn)生了巨大的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[9]。

枯草芽孢桿菌HS8(BacillussubtilisHS8)為黃芪內(nèi)生細(xì)菌，具有明顯、清新、持久、愉悅的香味，為了開發(fā)枯草芽孢桿菌HS8并合理利用其芳香氣味，本文以黃芪生藥為對(duì)照，采用GC-MS法分析枯草芽孢桿菌HS8的揮發(fā)性成分，系統(tǒng)分析比較枯草芽孢桿菌HS8揮發(fā)性成分與宿主植物黃芪之間的相關(guān)性，并確定其芳香活性物質(zhì)，旨在合理開發(fā)新型芳香性枯草芽孢桿菌調(diào)味品，為擴(kuò)大枯草芽孢桿菌的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌HS8(BacillussubtilisHS8)：由黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn)室分離自健康黃芪植株；健康野生膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus)：采自黑龍江省大興安嶺地區(qū)；NA、NB培養(yǎng)基配制方法參閱文獻(xiàn)[10]；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A GC-240MS GC-MS 聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備

枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液樣品的制備：參閱文獻(xiàn)[11]，將HS8菌株接種于NA培養(yǎng)基，于37 ℃條件下恒溫活化培養(yǎng)3 d，取活化后的HS8菌株，在無菌條件下挑取菌絲體接種于60 mL NB培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)3 d，制成1×107CFU/mL的培養(yǎng)液；將種子液以5%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接至300 mL滅菌后的NB培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)5 d，將發(fā)酵液真空抽濾后，于50 ℃條件下減壓濃縮，將濃縮后的HS8菌株發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次(3×100 mL)，合并萃取液，于50 ℃低溫濃縮至干，用適量乙酸乙酯溶解，作為發(fā)酵液供試樣品，備用。

枯草芽孢桿菌HS8菌絲體樣品的制備：分別提取HS8菌株菌絲體，超聲破碎，并以乙酸乙酯萃取3次(3×100 mL)，合并萃取液，以下步驟同“枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液樣品的制備”，作為菌絲體供試樣品，備用。

對(duì)照藥材溶液的制備：分別稱取黃芪根及黃芪莖的干燥粉末各10 g，加入乙酸乙酯100 mL，超聲提取1 h，過濾后于50 ℃減壓濃縮至10 mL，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，作為黃芪對(duì)照藥材液，冷藏備用。

空白對(duì)照品溶液的制備：取NB培養(yǎng)基(不接種內(nèi)生細(xì)菌)，于50 ℃減壓濃縮，同“枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液樣品的制備”處理，作為培養(yǎng)基空白對(duì)照品，備用。

1.3.2 GC-MS條件

MS條件：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲2.5 min；數(shù)據(jù)采集方式為Scan；檢測(cè)器增益電壓1.18 kV；質(zhì)量掃描范圍40～450 m/z。

1.3.3 分析測(cè)試

采用 GC-MS對(duì)HS8菌株揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)[12]，確定樣品揮發(fā)性成分中的主要成分，使用面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性成分總離子流圖

采用GC-MS法，分別對(duì)枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液、菌絲體、黃芪根、黃芪莖及空白培養(yǎng)基對(duì)照品進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，其總離子流圖見圖1～圖5。

圖1 HS8發(fā)酵液揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖

圖2 HS8菌絲體揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖

圖3 黃芪根部揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖

圖4 黃芪莖揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖

圖5 NB培養(yǎng)基揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖

由圖1～圖5可知，枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液中分離出揮發(fā)性物質(zhì)37種，鑒定了其中的21種成分；菌絲體中分離出22種，鑒定了其中的18種成分；黃芪根中分離出揮發(fā)性物質(zhì)16種，鑒定了其中的14種成分；黃芪莖中分離出34種，鑒定了其中的17種成分；空白培養(yǎng)基中含有7種揮發(fā)性物質(zhì)，鑒定了其中的4種成分。

2.2 枯草芽孢桿菌HS8揮發(fā)性成分分析

以宿主植物黃芪為對(duì)照，對(duì)枯草芽孢桿菌HS8揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，結(jié)果見表1和表2。為排除培養(yǎng)基中成分對(duì)分析結(jié)果的干擾，同法對(duì)空白培養(yǎng)基也進(jìn)行了揮發(fā)性成分的分析，結(jié)果見表3。

表1 枯草芽孢桿菌HS8揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果

表2 黃芪揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果

表3 NB培養(yǎng)基揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果

對(duì)比表1～表3分析結(jié)果可知，除去與培養(yǎng)基中相同的揮發(fā)性成分，在枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液及菌絲體揮發(fā)性成分中均含有與黃芪根、莖相同的正二十七烷；同時(shí)，在枯草芽孢桿菌HS8菌絲體揮發(fā)性成分中檢測(cè)出β-谷甾醇，而在黃芪根揮發(fā)性成分中卻存在γ-谷甾醇；此外，枯草芽孢桿菌HS8發(fā)酵液及菌絲體揮發(fā)性成分中還存在其特異性揮發(fā)性成分。

3 結(jié)論

分離自健康野生黃芪植株的枯草芽孢桿菌HS8可產(chǎn)生清新、愉悅、持久的香味，GC-MS分析表明，枯草芽孢桿菌HS8含有大量揮發(fā)性成分，這些成分中存在著與宿主植物黃芪相同、相似及全新的揮發(fā)性成分，說明枯草芽孢桿菌HS8與宿主植物黃芪可能具有相同的代謝機(jī)制。作為農(nóng)業(yè)部和FDA認(rèn)定的安全性菌株[13,14]，枯草芽孢桿菌的開發(fā)與利用正在成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一，上述研究為枯草芽孢桿菌HS8作為益生菌在調(diào)味香料的生產(chǎn)方面奠定了基礎(chǔ)[15]，提供了新資源，不僅能夠彌補(bǔ)調(diào)味香料植物生產(chǎn)方面的不足，同時(shí)也為內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物的互作機(jī)理提供了研究基礎(chǔ)。