壽瑋齡，陳倩，范連凱，張建平，吳衛(wèi)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730)

狼瘡抗凝物(lupus anticoagulant，LA)是一組能直接與負(fù)電荷磷脂或磷脂蛋白復(fù)合物結(jié)合的免疫球蛋白，為抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，APA)中的一種[1]。LA可見(jiàn)于抗磷脂抗體綜合征(antiphospholipid syndrome，APS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)及結(jié)締組織病(connective tissue diseases，CTD)等多種疾病，與患者動(dòng)靜脈血栓和病態(tài)妊娠風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[2]。

現(xiàn)行LA的檢測(cè)方法大多基于LA與磷脂結(jié)合可延長(zhǎng)磷脂依賴的凝血試驗(yàn)時(shí)間這一原理，而活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)試驗(yàn)和稀釋蝰蛇毒磷脂時(shí)間(diluted Russell viper venom time，dRVVT)試驗(yàn)為指南推薦和文獻(xiàn)報(bào)道常用的檢測(cè)方法[3-5]。本研究根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)文件和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《臨床血液學(xué)檢測(cè)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》(WS/T 406—2012)，評(píng)價(jià)3種不同dRVVT檢測(cè)系統(tǒng)的性能是否滿足臨床檢測(cè)需求[6-8]。目前，尚未見(jiàn)針對(duì)3種dRVVT試驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果一致性評(píng)價(jià)的相關(guān)研究報(bào)道，而3種檢測(cè)系統(tǒng)推薦結(jié)果表達(dá)方式和試驗(yàn)流程亦不相同。本研究在分析不同檢測(cè)系統(tǒng)間結(jié)果一致性的基礎(chǔ)上，探討不同檢驗(yàn)流程對(duì)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集與處理 采集2019年11月至12月北京協(xié)和醫(yī)院門(mén)診、住院患者及體檢健康者靜脈血2.7 mL，與枸櫞酸鈉(109 mmol/L)抗凝劑按比例9∶1混勻，1 h內(nèi)以離心力2 500×g離心10 min獲得血漿樣品，4 h內(nèi)完成檢測(cè)。血漿樣品均無(wú)溶血、凝血、乳糜現(xiàn)象，血細(xì)胞比容<55%。本研究通過(guò)北京協(xié)和醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：ZS-2598)。

1.2主要儀器與試劑 系統(tǒng)1： 試劑Staclot?DRVV SCREEN/CONFIRM(批號(hào)254229/253933)、質(zhì)控品及STA-R Evolution?全自動(dòng)凝血分析儀由法國(guó)Stago公司提供；系統(tǒng)2：試劑dRVVT Screen/Confirm(批號(hào)：N0889953/N0688573)、質(zhì)控品及ACL TOP 700全自動(dòng)凝血分析儀由美國(guó)Instrumentation Laboratory(IL)公司提供；系統(tǒng)3：試劑LA1 Screening reagent/LA2 Confirmation reagent(批號(hào)：549993A/548866A)、質(zhì)控品由德國(guó)Siemens公司提供，CS5100全自動(dòng)凝血分析儀由日本Sysmex公司提供。

1.3方法

1.3.3攜帶污染率 取高值血漿樣品1份，連續(xù)測(cè)定3次；再取低值血漿樣品1份，連續(xù)測(cè)定3次。將測(cè)定結(jié)果記為H1、H2、H3和L1、L2、L3，計(jì)算攜帶污染率。攜帶污染率=|L1-L3|/(H3-L3)×100%。

1.3.4參考區(qū)間(RI)/cut-off值驗(yàn)證 收集40例表觀健康人枸櫞酸鈉抗凝血漿樣品，男20例，年齡22～60歲，女20例，年齡18～65歲。分別用3種系統(tǒng)檢測(cè)LA水平，按照試劑說(shuō)明書(shū)要求驗(yàn)證RI/cut-off值適用性。判斷標(biāo)準(zhǔn)：40例驗(yàn)證數(shù)據(jù)與說(shuō)明書(shū)RI/cut-off值比較，超出RI/cut-off值的檢測(cè)數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)≤10%時(shí)，驗(yàn)證通過(guò)。

1.3.5結(jié)果比對(duì) 收集136例枸櫞酸鈉抗凝血漿樣品，男55例，女81例，年齡11～79歲。其中免疫系統(tǒng)疾病56例(APS 19例，SLE 24例，CTD等其他免疫系統(tǒng)疾病13例)、血栓性疾病12例，孕史不良4例，其他29例，健康體檢者35例。暫以常規(guī)檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果判定選擇血漿樣品，分別覆蓋陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性范圍。在2 h內(nèi)分別用3個(gè)不同系統(tǒng)檢測(cè)LA水平，分析檢測(cè)結(jié)果間一致性。

1.3.6不同檢驗(yàn)流程結(jié)果分析 系統(tǒng)1和系統(tǒng)2說(shuō)明書(shū)推薦同時(shí)進(jìn)行LA篩選和確認(rèn)試驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)化比值(NR)表示。系統(tǒng)3說(shuō)明書(shū)推薦流程為：(1)LA篩查試驗(yàn)正常，提示LA陰性；(2)LA篩選試驗(yàn)延長(zhǎng)，進(jìn)行LA確認(rèn)試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果以篩選/確認(rèn)比值(R)表示。系統(tǒng)3分析136例血漿樣品，采用說(shuō)明書(shū)推薦流程以R為結(jié)果報(bào)告方式和同時(shí)進(jìn)行篩選、確認(rèn)試驗(yàn)以NR為結(jié)果報(bào)告方式的2種檢測(cè)流程。

檢測(cè)LA的篩選及確認(rèn)試驗(yàn)直接用dRVVT試驗(yàn)測(cè)定的凝固時(shí)間(s)表示。NR=篩選比值/確認(rèn)比值，篩選比值=篩選試驗(yàn)時(shí)間(s)/ 篩選試驗(yàn)正常均值(s)，確認(rèn)比值=確認(rèn)試驗(yàn)時(shí)間(s)/ 確認(rèn)試驗(yàn)正常均值(s)。R=篩選試驗(yàn)時(shí)間(s)/ 確認(rèn)試驗(yàn)時(shí)間(s)。

2 結(jié)果

2.1精密度 見(jiàn)表1、2。3種系統(tǒng)檢測(cè)3個(gè)水平血漿樣品LA水平，重復(fù)性以CV表示，為0.44%～1.69%；期間精密度以CV表示，為1.43%～2.43%。

表1 3種LA檢測(cè)方法的重復(fù)性結(jié)果

表2 3種LA檢測(cè)方法的期間精密度結(jié)果

2.2攜帶污染率 3種LA檢測(cè)方法以NR為結(jié)果表示方式，攜帶污染率分別為1.03%、0.00%和0.91%；方法3以R為結(jié)果表示方式，攜帶污染率為0.91%，絕對(duì)值均小于3.00%。

2.3RI/cut-off值驗(yàn)證 系統(tǒng)1和系統(tǒng)2按照說(shuō)明書(shū)以NR為結(jié)果表達(dá)方式，40例表觀健康人血漿樣品LA檢測(cè)結(jié)果分別為0.89～1.15和0.87～1.20，RI/cut-off值驗(yàn)證通過(guò)。系統(tǒng)3檢測(cè)按照說(shuō)明書(shū)以R為結(jié)果表示方式，LA檢測(cè)結(jié)果為1.02～1.29，其中7例超出1.20，驗(yàn)證不通過(guò)；若以NR為結(jié)果表示方式，LA檢測(cè)結(jié)果為0.80～1.13，均在1.20以內(nèi)。

2.4結(jié)果比對(duì) 見(jiàn)表3、4。不同系統(tǒng)間篩選試驗(yàn)、確認(rèn)試驗(yàn)及比值結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，系統(tǒng)3的2種不同結(jié)果表示方法間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-10.128，P=0.000)。

以指南推薦NR≥1.20為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，3種系統(tǒng)檢測(cè)136例血漿樣品的LA陽(yáng)性率分別為53.7%、65.4%、56.6%(系統(tǒng)3以NR為結(jié)果表示方式)和71.3%(系統(tǒng)3以R為結(jié)果表示方式)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.333，P=0.010)，其中系統(tǒng)3的 R結(jié)果陽(yáng)性率高于NR結(jié)果陽(yáng)性率。

表3 3種檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)比對(duì)結(jié)果(n=136)

表4 3種檢測(cè)系統(tǒng)陰陽(yáng)性判斷結(jié)果(n=136)[n(%)]

2.5不同檢驗(yàn)流程結(jié)果分析 系統(tǒng)3按照說(shuō)明書(shū)流程檢測(cè)血漿樣品LA水平，篩選試驗(yàn)正常共53例，其中2例NR結(jié)果分別為1.21和1.23，R結(jié)果分別為1.39和1.40，存在假陰性。系統(tǒng)1檢測(cè)上述2例血漿樣品LA水平，NR結(jié)果分別為1.22和1.20，系統(tǒng)2檢測(cè)上述2例血漿樣品，NR結(jié)果分別為1.32和1.24。

3 討論

LA檢測(cè)可分為以下3個(gè)流程：(1)篩選試驗(yàn)：磷脂依賴的凝血試驗(yàn)延長(zhǎng)，提示可能存在循環(huán)抑制物；(2)1∶1混合試驗(yàn)：證實(shí)凝血時(shí)間延長(zhǎng)不是由凝血因子缺乏導(dǎo)致；(3)確認(rèn)試驗(yàn)：試劑中含高濃度磷脂，以證實(shí)循環(huán)抑制物具有磷脂依賴性[5]。

目前，國(guó)際指南均推薦基于凝血過(guò)程共同途徑的dRVVT試驗(yàn)為L(zhǎng)A首選檢測(cè)方法之一，Thiagarajan等[9]于1986年首次報(bào)道了該方法。本研究驗(yàn)證3種不同系統(tǒng)dRVVT法檢測(cè)性能，各系統(tǒng)重復(fù)性以CV表示，小于1.70%，期間精密度以CV表示，小于2.50%，與試劑說(shuō)明書(shū)數(shù)據(jù)基本一致。WS/T 406—2012規(guī)定準(zhǔn)確度驗(yàn)證應(yīng)使用至少5份質(zhì)評(píng)物，但因缺少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本次驗(yàn)證無(wú)LA檢測(cè)的準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)。

各指南推薦以健康人群第97.5百分位數(shù)或第99百分位數(shù)設(shè)置RI/cut-off值。對(duì)于LA檢測(cè)方法所提及cut-off值不同于根據(jù)ROC曲線所建立的cut-off值概念。系統(tǒng)3以R為結(jié)果表達(dá)方式時(shí)，RI/cut-off值驗(yàn)證未通過(guò)；提示各實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室儀器及試劑對(duì)每一種LA檢測(cè)方法建立或驗(yàn)證各實(shí)驗(yàn)室RI/cut-off值，包括糾正百分比等計(jì)算值[5,10-11]。

因試劑種類(lèi)、磷脂構(gòu)成和濃度、原理的不同，以及終點(diǎn)判斷方式的不同等均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果[12-13]。本研究比較不同系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果一致性并初步探討不同流程間差異，提示臨床對(duì)于LA結(jié)果解釋需關(guān)注檢測(cè)系統(tǒng)的差異。系統(tǒng)3中，R結(jié)果陽(yáng)性率(71.3%)高于NR結(jié)果(56.6%)，篩選試驗(yàn)53例陰性血漿樣品，2例按照NR表示結(jié)果分別為1.21和1.23，R結(jié)果分別為1.39和1.40，存在假陰性現(xiàn)象；提示實(shí)驗(yàn)室結(jié)合臨床需求，對(duì)所采用檢測(cè)系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)的推薦流程進(jìn)行驗(yàn)證。

此外，LA檢測(cè)對(duì)分析前質(zhì)量控制要求嚴(yán)格[14]。對(duì)于以NR報(bào)告結(jié)果的檢測(cè)方法，在更換LA試劑批號(hào)時(shí)需重新確定篩選試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn)正常血漿均值?；颊哌M(jìn)行肝素、華法林及直接口服抗凝藥等抗凝劑治療時(shí)可產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[15-17]，3種試劑中均含有肝素中和成分，可中和0.8～1.0 IU/mL普通肝素，從而減少普通肝素對(duì)LA檢測(cè)的影響。同時(shí)，LA可在感染、腫瘤和藥物治療患者中一過(guò)性出現(xiàn)，只有間隔12周且2次及以上檢測(cè)LA仍存在，才能診斷抗磷脂抗體綜合征[1]。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與臨床醫(yī)生進(jìn)行及時(shí)有效的溝通，對(duì)患者的檢測(cè)結(jié)果做出正確解釋。