陳瑩，賈艷增，時(shí)東彥，宋文杰，史雨微(.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，石家莊 05007；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000)

諾卡菌屬于需氧放線菌，廣泛分布于腐生土壤及水和灰塵中，可造成免疫低下人群感染，其感染病例報(bào)道呈上升趨勢(shì)[1]。隨著實(shí)驗(yàn)室的診斷技術(shù)不斷提高，諾卡菌的分離率愈來(lái)愈高，但是國(guó)內(nèi)關(guān)于諾卡菌的地區(qū)分布報(bào)道不多，且菌株數(shù)量也較少[2-3]。本研究收集2016—2019年河北地區(qū)10多家醫(yī)院分離的諾卡菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)一鑒定，結(jié)合臨床資料探討其標(biāo)本分布特征，以期為諾卡菌的臨床診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1菌株分離 收集2016—2019年河北地區(qū)10多家醫(yī)院(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、河北省人民醫(yī)院、河北省中醫(yī)院、河北省胸科醫(yī)院、廊坊市人民醫(yī)院、滄州市中心醫(yī)院、滄州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院、邢臺(tái)市人民醫(yī)院、遵化市人民醫(yī)院、華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院、承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、保定市傳染病醫(yī)院、秦皇島市第三醫(yī)院、張家口市第一醫(yī)院等)臨床分離諾卡菌94株，均為非重復(fù)分離株，結(jié)合臨床癥狀和影像學(xué)檢查確定為致病菌[1,4]。94株諾卡菌分離自下呼吸道標(biāo)本68株(72.3%)、分泌物標(biāo)本20株(21.3%)、血液標(biāo)本3株(3.2%)、肺膿腫標(biāo)本1株(1.1%)、腦膿腫標(biāo)本1株(1.1%)和腦脊液標(biāo)本1株(1.1%)。分離菌株根據(jù)菌落形態(tài)和改良抗酸染色進(jìn)行初步鑒定，并于-70 ℃保存。菌株分離患者中位年齡60歲，其中，男性52例，女性42例。

1.2主要試劑及儀器 去離子水(天根公司)，研磨小杵、2×Es Taq Master Mix(Dye)(北京康為世紀(jì)生物公司)；HX-20恒溫金屬浴(上海滬實(shí)業(yè)公司)，HC-2518高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器公司)，621BR50860 T100 Thermal Cycler、733BR0192 ChemiDoc Imaging System(Bio-Rad公司)，JY600C電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司)，Nano Drop 2000(超微量)分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司)，ABI 3730XL DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems公司)，Vitek MS分枝桿菌/諾卡菌試劑盒、Vitek MS質(zhì)譜儀(法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.3菌株DNA提取 取血平板上菌落，用研磨小杵使諾卡菌乳化分散于100 μL去離子水中，100 ℃煮沸10 min，10 625×g離心10 min，取上清液作為模板。用分光光度計(jì)評(píng)價(jià)DNA的純度和含量，A260 nm/A280 nm>1.8為合格。

1.4基因擴(kuò)增及測(cè)序 參照文獻(xiàn)[5-6]合成16S rRNA和secA1基因擴(kuò)增引物，引物序列見(jiàn)表1，由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2×Es Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化送上海生工公司采用3730XL DNA測(cè)序儀進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序。序列與NCBI的基因庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)CLSI MM18-A[7]，若16S rRNA序列與模式菌相似度≥99.0%，且與其他種相似度之差大于0.8%，鑒定為種；若相似度<99.0%或相似度≥99.0%且與其他種相似度之差小于0.8%，則進(jìn)行secA1序列分析與模式菌相似性達(dá)到≥99.0%鑒定到種。

表1 16S rRNA及secA1基因PCR擴(kuò)增引物及產(chǎn)物大小

1.5基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定 取一環(huán)待測(cè)菌加入含0.5 mm玻璃珠和500 μL 70%乙醇的1.5 mL離心管中，震蕩5 min，室溫放置10 min，將菌懸液轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，10 625×g離心2 min，棄上清液，向沉淀中加入10 μL 70%甲酸并室溫放置5 min，加入10 μL乙腈混勻，10 625×g離心2 min，取1 μL上清液涂于靶板，待干燥加入1 μL基質(zhì)，干燥后進(jìn)行MS分析。校準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌ATCC 8739。鑒定值99.9%則鑒定到種；無(wú)鑒定結(jié)果或鑒定值小于99.9%，則無(wú)法鑒定到種。

2 結(jié)果

2.1諾卡菌菌株鑒定結(jié)果 94株諾卡菌經(jīng)基因測(cè)序全部鑒定到種，80株(85.1%)經(jīng)MALDI-TOF MS成功鑒定到種，見(jiàn)表2。MALDI-TOF MS未鑒定到種的包括3株膿腫諾卡菌(無(wú)鑒定值)、4株亞洲諾卡菌(無(wú)鑒定值)、2株膿液諾卡菌(無(wú)鑒定值)、2株華萊士諾卡菌(無(wú)鑒定值)、1株新諾卡菌(50%鑒定值)、1株北京諾卡菌(無(wú)鑒定值)和1株南非諾卡菌(無(wú)鑒定值)。

2.2不同部位諾卡菌的分離情況 68份下呼吸道標(biāo)本分離菌種分別為圣喬治教堂諾卡菌33株(48.5%)、皮疽諾卡菌11株(16.2%)、豚鼠耳炎諾卡菌8株(11.8%)、膿腫諾卡菌4株(5.9%)、亞洲諾卡菌4株(5.9%)、巴西諾卡菌2株(2.9%)、華萊士諾卡菌2株(2.9%)、膿液諾卡菌1株(1.5%)、南非諾卡菌1株(1.5%)、北京諾卡菌1株(1.5%)和新諾卡菌1株(1.5%)。20份分泌物標(biāo)本分離菌種分別為巴西諾卡菌5株(25.0%)、皮疽諾卡菌5株(25.0%)、圣喬治教堂諾卡菌4株(20.0%)、膿腫諾卡菌3株(15.0%)、豚鼠耳炎諾卡菌2株(10.0%)和膿液諾卡菌1株(5.0%)。3份血液標(biāo)本分離菌種分別為皮疽諾卡菌2株(66.7%)和圣喬治教堂諾卡菌1株(33.3%)。肺膿腫標(biāo)本、腦膿腫標(biāo)本和腦脊液標(biāo)本分離菌種均為皮疽諾卡菌。

3 討論

諾卡菌生長(zhǎng)緩慢，生化反應(yīng)不活潑，其菌種鑒定效果不佳。質(zhì)譜技術(shù)可解決部分諾卡菌的鑒定，但在某些種的鑒定上仍需依靠分子測(cè)序技術(shù)[8]。本研究94株臨床分離諾卡菌經(jīng)質(zhì)譜鑒定至種的占85.1%，膿液諾卡菌、亞洲諾卡菌、南非諾卡菌在本研究使用的質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)中缺乏鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)；而對(duì)于膿腫諾卡菌嗜瓊脂生長(zhǎng)特點(diǎn)，蛋白質(zhì)提取時(shí)可能存在瓊脂的干擾而導(dǎo)致質(zhì)譜圖譜分辨率降低；非洲諾卡菌和新諾卡菌屬于新諾卡菌群，華萊士諾卡菌和南非諾卡菌屬于南非菌群，質(zhì)譜無(wú)法有效區(qū)分。94株臨床分離諾卡菌采用16S rRNA測(cè)序鑒定至種的占97.9%，有2株華萊士諾卡菌補(bǔ)充secA1序列后成功鑒定。16S rRNA基因序列中物種間多態(tài)性不夠，某些親緣關(guān)系較近物種可能無(wú)法進(jìn)行區(qū)分，而對(duì)于南非諾卡菌復(fù)合群，secA1具有更多的物種間多態(tài)性，在識(shí)別南非諾卡菌和華萊士諾卡菌中可作為16S rRNA的補(bǔ)充鑒定[6]。

94株臨床分離諾卡菌包括11個(gè)諾卡菌種。圣喬治教堂諾卡菌分離率最高，其次為皮疽諾卡菌和豚鼠耳炎諾卡菌。美國(guó)臨床分離率最高菌種為新諾卡菌，其次皮疽諾卡菌和巴西諾卡菌[9]；加拿大最主要流行菌種是新諾卡菌，圣喬治教堂諾卡菌和皮疽諾卡菌較多[10]；澳大利亞主要分離菌種為新諾卡菌、圣喬治教堂諾卡菌、巴西諾卡菌和皮疽諾卡菌[11]；法國(guó)最常見(jiàn)分離菌種為皮疽諾卡菌、膿腫諾卡菌、新諾卡菌、圣喬治教堂諾卡菌[12]；而泰國(guó)，皮疽諾卡菌、北京諾卡菌和圣喬治教堂諾卡菌是主要分離諾卡菌種[13]。北京朝陽(yáng)醫(yī)院圣喬治教堂諾卡菌臨床分離率最高，皮疽諾卡菌次之[2]。以上各個(gè)文獻(xiàn)表明，不同國(guó)家菌種分布有所不同，美國(guó)和澳大利亞最常見(jiàn)分離菌種為新諾卡菌，而法國(guó)和泰國(guó)最常見(jiàn)分離菌種為皮疽諾卡菌，而北京朝陽(yáng)醫(yī)院和本研究報(bào)道以圣喬治教堂諾卡菌最常見(jiàn)。

本研究分離的諾卡菌中以呼吸道標(biāo)本占比最高，達(dá)到72.3 %，其次為分泌物標(biāo)本(21.3%)。而呼吸道標(biāo)本分離率最高的是圣喬治教堂諾卡菌，其次為皮疽諾卡菌，第3位為豚鼠耳炎諾卡菌。分泌物標(biāo)本中分離率最高的是皮疽諾卡菌和巴西諾卡菌，其次為圣喬治教堂諾卡菌。梅奧醫(yī)學(xué)中心分離率最高的部位是呼吸道，其中最常分離新諾卡菌、圣喬治教堂諾卡菌和皮疽諾卡菌[14]。西班牙臨床分離菌株中85.9%分離于呼吸道，以圣喬治教堂諾卡菌和新諾卡菌常見(jiàn)[15]。諾卡菌的臨床感染部位多數(shù)國(guó)家以肺部感染常見(jiàn)，皮膚感染次之；不同的標(biāo)本類型菌種分布也不相同。了解諾卡菌的地區(qū)性分布及不同樣本來(lái)源菌種分布，對(duì)臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥具有指導(dǎo)意義。