張澤，張穎聰，于洪偉，榮勝忠，高宏民，常東(復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海201399)

近年來，生物傳感器廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病篩查等方面[1-2]，構(gòu)建性能優(yōu)異的生物傳感器是目前研究人員一直追尋的目標(biāo)。生物傳感器由識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換器組成，能夠?qū)⑻囟悠分写郎y(cè)組分特異性識(shí)別并轉(zhuǎn)換為可讀取的信號(hào)進(jìn)行輸出。識(shí)別元件又稱為目標(biāo)受體，是生物傳感器的重要組成部分，其性能優(yōu)良程度直接關(guān)系到傳感器的選擇性能。經(jīng)典的識(shí)別元件多為從生物體內(nèi)分離出的酶或抗體等，研究時(shí)間較早且研究范圍也較為廣泛。然而考慮到快速診斷、提高穩(wěn)定性和成本效益等方面的需要，研究人員逐步研發(fā)新的識(shí)別元件來提高傳感器的識(shí)別性能，如噬菌體、適配體等，這不僅綜合提高了傳感器的分析性能，而且還拓展了生物傳感器的應(yīng)用范圍，促進(jìn)了生物傳感器向?qū)嶋H產(chǎn)品檢測(cè)的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。目前，生物傳感器已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的研究中，如體內(nèi)生物小分子檢測(cè)、病原微生物檢測(cè)[3]、藥物檢測(cè)[4]和疾病標(biāo)志物檢測(cè)[5]。本文將對(duì)生物傳感器識(shí)別元件的種類及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

生物傳感器中的識(shí)別元件要對(duì)目標(biāo)物具有穩(wěn)定且特異的識(shí)別能力。如表1所示，目前識(shí)別元件可分為經(jīng)典識(shí)別元件，如酶、抗體、DNA、細(xì)胞和組織，以及新型識(shí)別元件，如核酸適配體，分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)、噬菌體、親合體和脫氧核酶[6]。

表1 生物傳感器中識(shí)別元件的特點(diǎn)

1 經(jīng)典識(shí)別元件

自1962年第1個(gè)葡萄糖生物傳感器[7]問世以來，以酶作為識(shí)別元件的生物傳感器不斷發(fā)展。隨著研究的進(jìn)一步深入，基于抗原抗體特異性識(shí)別、核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原理發(fā)展了多種類別的生物傳感器。依據(jù)識(shí)別元件的類別可將生物傳感器分為酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器和DNA傳感器等，這些傳感器所涉及到的經(jīng)典識(shí)別元件主要有以下幾種：

1.1酶 在酶生物傳感器的構(gòu)建中，主要有2個(gè)應(yīng)用方面，一種是利用酶對(duì)分析物進(jìn)行催化代謝，除了早期葡萄糖氧化酶被用作敏感的識(shí)別元件外，一些檢測(cè)生物小分子的酶也逐漸被應(yīng)用于固化酶膜的構(gòu)建，例如葡萄糖脫氫酶、尿酸酶等；另一種是利用某些化合物能夠抑制酶的活性所構(gòu)建的傳感器，典型的代表是對(duì)農(nóng)藥含量的檢測(cè)，Zhang等[8]利用乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)、復(fù)合納米材料和聚合物構(gòu)建安培型生物傳感器檢測(cè)三氯磷酸酯和馬拉硫磷這2種有機(jī)磷農(nóng)藥。

酶作為識(shí)別元件其操作簡(jiǎn)便，特異性好。缺點(diǎn)在于酶的純化成本較高且費(fèi)時(shí)，穩(wěn)定性欠佳。目前該領(lǐng)域的進(jìn)展方向是合成納米酶，由于納米酶價(jià)格便宜且穩(wěn)定性好適合構(gòu)建納米酶?jìng)鞲衅麝嚵校垣@得較高的檢測(cè)通量。

1.2抗體 抗體是生物傳感器中應(yīng)用范圍最廣的識(shí)別元件，根據(jù)其制備方法和原理，可分為多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。目前，對(duì)于免疫傳感器的研究非常廣泛，如蛋白質(zhì)、毒素和生物標(biāo)志物等方面的檢測(cè)[9]。隨著免疫傳感器的不斷發(fā)展，更多信號(hào)放大策略被應(yīng)用其中。研究人員在構(gòu)建基于免疫復(fù)合物檢測(cè)的生物傳感器中引入“法拉第籠概念”[10]，與傳統(tǒng)的三明治式免疫分析相比，其靈敏度顯著提升。

但抗體作為識(shí)別元件其檢測(cè)目標(biāo)有限、成本高、穩(wěn)定性欠佳。目前，利用生物、化學(xué)、基因等方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)合成雙官能團(tuán)抗體，這類抗體具有2個(gè)不同的抗原結(jié)合區(qū)，能同時(shí)識(shí)別2種抗原，未來有望應(yīng)用于新型免疫生物傳感器。

1.3DNA DNA傳感器也是研究較為廣泛的一種，DNA作為識(shí)別元件特異性較強(qiáng)。通常依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，通過換能器將信號(hào)輸出，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)核酸特異性識(shí)別檢測(cè)[11-12]。DNA傳感器又稱為基因傳感器，針對(duì)疾病相關(guān)基因的準(zhǔn)確檢測(cè)具有重要意義。隨著研究的不斷深入，核酸傳感器構(gòu)建策略更加復(fù)雜。Zeng等[13]構(gòu)建了一種DNA四面體納米結(jié)構(gòu)，其檢測(cè)靈敏度到降低至1 fm，未來有望利用這種DNA四面體探頭對(duì)疾病相關(guān)DNA、miRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行即時(shí)定量檢測(cè)。

然而，DNA識(shí)別元件在檢測(cè)過程中存在雜交假象，堿基錯(cuò)配等現(xiàn)象。這些都會(huì)對(duì)DNA傳感器的靈敏度、重現(xiàn)性等性能產(chǎn)生影響，需要進(jìn)一步提高。

1.4細(xì)胞 細(xì)胞作為生物體基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，當(dāng)受到外界刺激后，產(chǎn)生的電信號(hào)經(jīng)過放大處理可對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。雖然細(xì)胞作為識(shí)別元件從監(jiān)測(cè)細(xì)胞生理性能、重金屬離子動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)到藥物篩選等方面被廣泛研究，但是仍有一些因素限制了細(xì)胞傳感器的進(jìn)一步發(fā)展，如再生性和可供選擇的細(xì)胞種類有限等，仍有許多問題有待解決。

1.5組織 組織傳感器通常是以動(dòng)植物組織薄片作為傳感器的識(shí)別元件，在電極表面形成生物敏感膜，利用組織中的酶對(duì)底物特異性催化，其工作原理與酶?jìng)鞲衅飨嗨疲M織中的酶活性更高，固定化程度更好，對(duì)于一些催化反應(yīng)不明確以及生物催化途徑不清楚的反應(yīng)無法直接用酶電極，只能應(yīng)用組織電極。然而，組織的敏感度不夠理想、反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、構(gòu)建電極過程復(fù)雜。

1.6微生物 1975年Divies研制了第一支微生物傳感器，開辟了生物傳感器的又一新領(lǐng)域，早期的微生物傳感器多利用細(xì)菌菌體作為識(shí)別元件，通過細(xì)胞固定化技術(shù)將活體微生物固定在電極上形成微生物膜，利用微生物的呼吸作用或菌體內(nèi)酶的催化作用，對(duì)反應(yīng)體系中消耗的溶解氧含量或產(chǎn)生電活性物質(zhì)來間接實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的定量檢測(cè)，通常分為呼吸活性型和代謝活性型兩種微生物傳感器，微生物作為識(shí)別元件成本低，壽命長(zhǎng)，但是由于菌體內(nèi)含有多種酶，使傳感器的選擇性和靈敏度受到限制，且底物需要通過細(xì)胞壁擴(kuò)散，響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。目前有研究通過加入特定的抑制劑能夠克服微生物的選擇性問題，同時(shí)開發(fā)新技術(shù)提高固化效率，育種高效耐毒的微生物是該領(lǐng)域的另一個(gè)研究方向。

2 新型識(shí)別元件

近年來，出于對(duì)高選擇性、穩(wěn)定性、成本效益等方面的考慮，人們開始探索新型識(shí)別元素用于傳感器的構(gòu)建，力求在靈敏度、選擇性、檢測(cè)限和信噪比等方面提高生物傳感器的綜合分析能力。目前研究較多的新型識(shí)別元件有以下幾種。

2.1核酸適配體 核酸適配體是一種經(jīng)體外合成和篩選的寡核苷酸序列，自身經(jīng)過卷曲和折疊形成具有一定功能的特定三級(jí)結(jié)構(gòu)，能夠與相應(yīng)的蛋白質(zhì)、離子或小分子物質(zhì)通過鍵絡(luò)合形成配合物。其目標(biāo)物有病毒顆粒、病原菌、細(xì)胞黏附分子等[14]，應(yīng)用范圍廣泛，在功能上類似于抗體，有化學(xué)抗體之稱，但適配體熱穩(wěn)定性好、批間差異小、成本低、適合低免疫原性抗原。 適配體的研發(fā)為生物傳感器的制備提供了一個(gè)新的檢測(cè)平臺(tái)。

由于核酸適配體在人為環(huán)境中合成，與生理環(huán)境不同，存在一些缺點(diǎn)，如結(jié)構(gòu)剛性不如抗體，易被核酸酶降解、親和力不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。但作為一種新型識(shí)別元件，核酸適配體具有巨大的應(yīng)用前景，未來有許多研究工作等待我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

2.2MIP MIP是一種在結(jié)合位點(diǎn)和化學(xué)空間結(jié)構(gòu)與模板分子或印跡分子相匹配的高分子聚合物，制備這種聚合物的方法稱為分子印跡技術(shù)。分子印跡的理論來源于免疫學(xué)，1972年Wulff小組首次報(bào)道制備出MIP[15]。經(jīng)過幾十年的研究，該技術(shù)趨于成熟。MIP具有高耐熱性、高耐化學(xué)和機(jī)械性，可以重復(fù)使用，且成本較低等優(yōu)點(diǎn)，近些年來也逐漸應(yīng)用于傳感器的構(gòu)建中。

這種新型高分子仿生材料的特異性功能類似于抗原-抗體相互作用，因此在替代生物抗體方面具有巨大潛力，被稱為人工抗體。但是MIP也存在一些局限性，如制作工藝較為復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、模板分子滲漏等不足，因此未來在免疫分析、模擬酶和納米生物傳感器等方面也會(huì)面臨巨大挑戰(zhàn)。

2.3噬菌體 噬菌體(phages)是一類能夠感染多種微生物的病毒的總稱，通過受體結(jié)合蛋白能夠?qū)?xì)菌表面的特異性受體進(jìn)行識(shí)別，每種噬菌體的靶宿主是一組特異的細(xì)菌，其作為識(shí)別元件可以在傳感器上構(gòu)建捕獲感應(yīng)層，噬菌體的擴(kuò)增和細(xì)菌內(nèi)容物的釋放可用作分析信號(hào)。噬菌體作為識(shí)別元件具有特異性高、韌性強(qiáng)和儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)展。Chai等[16]利用無線磁彈性(ME)生物傳感器直接檢測(cè)新鮮農(nóng)產(chǎn)品中的鼠傷寒沙門氏菌。Tolba等[17]利用含有噬菌體的電化學(xué)生物傳感器(內(nèi)溶酶菌CBD500噬菌體)檢測(cè)牛奶中的李斯特菌。

2.4親合體 親合體(affibodies)是一種介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類多種氨基酸組成的多肽，具有體積較小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、可人工合成等特點(diǎn)，其結(jié)合位點(diǎn)與抗體相似，但不易在體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)。在生物樣本檢測(cè)中，親合體也可以作為受體，與生物傳感器相結(jié)合[18]，這將是一個(gè)很有潛力的研究領(lǐng)域。目前親合體廣泛應(yīng)用于成像、診斷和治療等領(lǐng)域，但其作為生物傳感器識(shí)別元件的作用才剛剛起步，未來親合體憑借對(duì)目標(biāo)分析物較高的特異性親和能力，將會(huì)展現(xiàn)出巨大潛力。

2.5脫氧核酶 脫氧核酶(DNAzymes)是一種利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)合成的具有催化功能的單鏈DNA片段。因?yàn)槠渚哂懈咝У慕Y(jié)構(gòu)識(shí)別能力和催化活性，近年來被逐漸開發(fā)用作傳感器的識(shí)別元件。Huang等[19]研制了一種基于DNAzyme擴(kuò)增的無標(biāo)簽比色檢測(cè)凝血酶的傳感器。 Zhao等[20]開發(fā)了一種基于DNAzyme識(shí)別元件的多功能擴(kuò)增生物傳感平臺(tái)，用于檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)和酶活性。

3 生物傳感器在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展

由于生物傳感技術(shù)靈敏度較高并且儀器設(shè)備易小型化，目前被越來越多地用于復(fù)雜體系的線性分析和檢測(cè)中，特別是針對(duì)臨床檢驗(yàn)中標(biāo)本干擾物較多，以及床旁檢測(cè)的快速發(fā)展的需要，生物傳感器具有良好的發(fā)展前景?；谄錂z測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)換原理，生物傳感器通常被分為電化學(xué)、光學(xué)和壓電生物傳感器。其中，電化學(xué)生物傳感器是基于電位、電流或電阻轉(zhuǎn)換的原理檢測(cè)電活性物質(zhì)的產(chǎn)生或消耗，從而間接反映待測(cè)物濃度的大小。光學(xué)傳感器是利用分析物與換能器在吸收、發(fā)光、熒光、反射率和表面等離子體共振(SPR)等光學(xué)特性方面相互作用來實(shí)現(xiàn)定量或定性的檢測(cè)。壓電傳感器采用在外加交流電場(chǎng)作用下產(chǎn)生的共振，利用電氣元件和其他設(shè)備將待測(cè)壓力轉(zhuǎn)換成電量，從而進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)工作。目前已經(jīng)研發(fā)了一些針對(duì)臨床檢驗(yàn)的生物傳感器，其中一些想法的提出能夠有效提高檢測(cè)的靈敏度和傳感平臺(tái)的穩(wěn)定性，近年來生物傳感器在臨床檢驗(yàn)方面研究的最新情況如下(表2)。

表2 生物傳感器應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)方面研究的相關(guān)參數(shù)

3.1生化免疫指標(biāo)檢測(cè) 通過對(duì)人體內(nèi)生化免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)疾病的篩查、診斷以及治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，最早研制的生物傳感器就是針對(duì)血液中葡萄糖進(jìn)行的檢測(cè)，目前商品化的便攜式血糖儀已經(jīng)廣泛引用于臨床血糖篩查，且家用式血糖生物傳感器占據(jù)全球巨大市場(chǎng)，其基本原理就是利用試紙條中固定的酶與待測(cè)血液中的葡萄糖反應(yīng)所產(chǎn)生的電流量進(jìn)行測(cè)定，主要的方法有葡萄糖氧化酶電極測(cè)量法和葡萄糖脫氫酶電極測(cè)量法等。此外，在世界范圍內(nèi)心腦血管疾病是導(dǎo)致殘疾和死亡的重要原因之一，對(duì)特定生化指標(biāo)檢測(cè)有助于識(shí)別高危風(fēng)險(xiǎn)患者，目前已經(jīng)有多種方法應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，生物傳感器也被考慮用于心肌標(biāo)志物等的快速檢測(cè)。Cho等[21]構(gòu)建了一種熒光免疫生物傳感器可同時(shí)檢測(cè)cTnI、CK-MB和肌紅蛋白，重復(fù)性良好，抗干擾性強(qiáng)且沒有樣品基質(zhì)造成的偽影。另外，其他的一些生化指標(biāo)也逐漸被檢測(cè)，Yu等[22]將尿酸氧化酶(UOx)固定于石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)修飾的玻碳電極上，該新型酶生物傳感檢測(cè)平臺(tái)能夠靈敏地檢測(cè)尿酸。Zou等[23]將銀團(tuán)簇的特性和雜化鏈反應(yīng)(HCR)相結(jié)合，構(gòu)建信號(hào)放大策略，利用ECL方法對(duì)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)活性分析和抑制劑評(píng)價(jià)。Ojeda等[24]提出構(gòu)建一次性電化學(xué)免疫傳感器，利用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法來檢測(cè)血清和尿液樣本中的雌二醇。截止目前，越來越多的生化指標(biāo)可以逐步應(yīng)用生物傳感器來進(jìn)行快速檢測(cè)。

3.2病原體檢測(cè) 當(dāng)人體免疫力降低時(shí)，如果遭受到病原體的侵襲會(huì)引發(fā)各種疾病，盡早對(duì)致病性的病原體進(jìn)行檢測(cè)，能夠有效查出病因并指導(dǎo)臨床合理用藥。研究人員探索利用生物傳感器對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)，Zhang等[25]將單鏈DNA探針固定于雜化膜上，構(gòu)建無標(biāo)記DNA電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)肺炎克雷伯菌。Yi等[10]利用針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌(S. typh)的適配體構(gòu)成具有識(shí)別功能的復(fù)合分子識(shí)別元件，來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)S. typh的目的。Safavieh等[26]研制了定量檢測(cè)大腸桿菌檢測(cè)的微流體電化學(xué)生物傳感器。Babamiri等[27]構(gòu)建MIP靈敏檢測(cè)人體免疫缺陷病毒(HIV)，利用HIV適配體作為模板，寡核苷酸鏈作為探針，未來該方法可推廣用于檢測(cè)其他DNA生物標(biāo)志物。

3.3腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 腫瘤標(biāo)志物是一類由腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)所產(chǎn)生或是人體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)所產(chǎn)生的物質(zhì)，主要可分為胚胎抗原、組織特異性抗原、糖蛋白、miRNA等。 確定血液或組織中腫瘤標(biāo)志物的水平對(duì)癌癥篩查至關(guān)重要。對(duì)腫瘤標(biāo)志物的快速準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)疾病的診療、監(jiān)測(cè)具有重要意義。目前，已經(jīng)研發(fā)了多種可以檢測(cè)不同種類標(biāo)志物的生物傳感器。Cao等[28]構(gòu)建了競(jìng)爭(zhēng)型檢測(cè)前列腺特異性抗原(PSA)的適配體傳感器，借助葡萄糖氧化酶(GOD)催化葡萄糖原位生成H2O2，實(shí)現(xiàn)多重放大效應(yīng)提高該適配體傳感器的靈敏度和選擇性。Mo等[29]利用4-巰基苯基硼酸(MPBA)親和三明治電化學(xué)發(fā)光(ECL)傳感器來檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)，是一種新穎、簡(jiǎn)單、普遍適用的糖蛋白印跡方法。腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)能夠提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，Babamiri等[30]將針對(duì)CA125和CA15-3兩種腫瘤標(biāo)志物的Ab1固定于Fe3O4@SiO2/聚合物復(fù)合物構(gòu)建的放大平臺(tái)上，成功構(gòu)建多元超敏ECL免疫傳感器檢測(cè)。近些年來對(duì)于miRNA與腫瘤之間相關(guān)性的研究成為熱點(diǎn)，對(duì)其準(zhǔn)確檢測(cè)將會(huì)對(duì)癌癥的診斷和靶基因的治療具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值，F(xiàn)eng等[31]利用絲網(wǎng)印刷碳電極多通路比率分析檢測(cè)miRNA-21和miRNA-141。未來生物傳感器發(fā)展方向是在同一檢測(cè)平臺(tái)固定多種針對(duì)不同腫瘤標(biāo)志物的識(shí)別元件，實(shí)現(xiàn)高通量腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)。除此之外還有多種生物傳感器被研究應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)診斷，如急性白血病臨床免疫分型的免疫傳感陣列，早期檢測(cè)設(shè)備植入后的細(xì)胞因子；藥物敏感性及藥物濃度生物傳感器的研制等。

4 總結(jié)

本文介紹了生物傳感器中兩大類識(shí)別元件及其在臨床檢驗(yàn)中的研究進(jìn)展，對(duì)不同識(shí)別元件的結(jié)構(gòu)、應(yīng)用范圍、優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)進(jìn)行了系統(tǒng)介紹。盡管經(jīng)典的識(shí)別元件早期已經(jīng)廣泛引領(lǐng)了生物傳感器的構(gòu)建，但現(xiàn)在仍有較大的發(fā)展活力。隨著人們對(duì)生物傳感器這一科學(xué)領(lǐng)域興趣的不斷提升，為了開發(fā)更加快速、有效、微型化的生物傳感檢測(cè)平臺(tái)，逐漸通過人工合成、體外篩選出能夠特異性識(shí)別目標(biāo)物的新型識(shí)別元件。目前，新型生物傳感識(shí)別元件仍然在發(fā)展中，利用基因工程技術(shù)合成特異性蛋白以及核糖體RNA探針的應(yīng)用是另外具有發(fā)展前景的研究方向，未來針對(duì)該領(lǐng)域的工作重點(diǎn)主要是在檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中如何提高生物傳感器識(shí)別元件對(duì)目標(biāo)物的特異性捕獲能力。同時(shí)，還要增強(qiáng)識(shí)別元件對(duì)抗外界干擾的能力，增加識(shí)別元件的耐受性能，延長(zhǎng)傳感器的使用壽命。還要利用納米材料為生物傳感器的構(gòu)建提供新的機(jī)遇，不斷探索識(shí)別元件與納米材料相結(jié)合的新性能，制造更加適用于臨床的生物傳感器。目前，許多生物傳感器的原型還沒有達(dá)到商業(yè)化階段，成果轉(zhuǎn)化需要進(jìn)一步推進(jìn)。希望未來在臨床診斷、食品分析、過程控制和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面將會(huì)具有更為廣闊的應(yīng)用前景。