王國(guó)祥， 劉 娟， 周志遠(yuǎn)， 劉 旭*

1. 復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放療科，上海 200032 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200032

海馬作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，與學(xué)習(xí)、記憶、癲癇密切相關(guān)[1-3]，是神經(jīng)生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病常用的載體，在神經(jīng)生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用[4-6]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，海馬神經(jīng)元需要從胎鼠或乳鼠提取進(jìn)行原代培養(yǎng)，無(wú)法像腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，因此無(wú)論從動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物倫理，還是盡量減少資源浪費(fèi)和保存珍稀動(dòng)物模型細(xì)胞樣本的角度出發(fā)，神經(jīng)元凍存后復(fù)蘇再利用都顯得尤為重要。

凍存細(xì)胞的常規(guī)操作是緩慢降溫，最后保存于-80℃冰箱或者液氮中。目前常用的冷凍保護(hù)劑有二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇和甘油等。既往研究[7-10]大多對(duì)凍存后海馬神經(jīng)元的形態(tài)進(jìn)行觀察，而未檢測(cè)其電生理功能，僅Quasthoff等[11]利用多電極微陣列(MEA)進(jìn)行了皮層神經(jīng)元凍存后整體神經(jīng)元放電情況觀察。海藻糖是一種非滲透性保護(hù)劑，由2個(gè)葡萄糖分子構(gòu)成，能穩(wěn)定生物膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使生物體免受氧化應(yīng)激的損傷，可應(yīng)用于多種細(xì)胞和器官凍存中[12-14]。本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)血清凍存液、DF12+10% DMSO凍存液、DF12+10% DMSO+海藻糖凍存液凍存細(xì)胞，評(píng)估其對(duì)海馬神經(jīng)元凍存復(fù)蘇后電活動(dòng)的影響，為建立穩(wěn)定的原代海馬神經(jīng)元保存技術(shù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原代海馬神經(jīng)元分離與混合培養(yǎng) 采用石瑩等[15]的方法：孕18～19 d SD大鼠，經(jīng)烏拉坦深度麻醉后，剖腹取胎鼠5～6只，快速去除頭皮及顱骨，取出完整的腦組織，分離海馬并去除血管。用預(yù)熱好的0.25%胰蛋白酶消化10～15 min，期間搖勻2～3次，用含10% 磷酸鹽緩沖液(FBS)的DF12培養(yǎng)基終止消化，用經(jīng)火焰拋光的玻璃滴管吹打20次左右，直到無(wú)明顯的組織塊。離心收集細(xì)胞，接種于預(yù)先用貼壁因子多聚賴(lài)氨酸(PDL)包被過(guò)的24孔板中。培養(yǎng)后每隔3 d更換NB27培養(yǎng)基(每次均為半換液)。第14～17天進(jìn)行膜片鉗檢測(cè)。

1.2 海馬神經(jīng)元冷凍保存及復(fù)蘇 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)當(dāng)天，分別用無(wú)血清凍存液(無(wú)血清組)、DF12+10% DMSO(DF12+DMSO組)、DF12+10% DMSO+0.1 mol/L海藻糖(DF12+DMSO+海藻糖組)凍存。

7 d后取出凍存的海馬神經(jīng)元，快速放入37℃水浴箱中解凍，然后以1 000r/min離心5 min，除去凍存液，對(duì)收集得到的海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)、接種。凍存成活率定義為復(fù)蘇當(dāng)日計(jì)數(shù)的海馬神經(jīng)元與原代分離的海馬神經(jīng)元數(shù)目之比。

1.3 神經(jīng)元電生理記錄 玻璃電極經(jīng)拉制后，電阻為3～5 MΩ，當(dāng)電極尖端與神經(jīng)元形成GO封接后，負(fù)壓吸破細(xì)胞，隨后進(jìn)行全細(xì)胞模式下電壓鉗或者電流鉗記錄。采集電流經(jīng)放大器Axonpatch 700B放大，由Digital 1440A采集后儲(chǔ)存。記錄動(dòng)作電位時(shí)，細(xì)胞外液含NaCl 128 mmol/L、葡萄糖 30 mmol/L、Hepes 25 mmol/L、KCl 5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgCl21 mmol/L，pH為7.3；細(xì)胞內(nèi)液含K-gluconate 125 mmol/L、KCl 10 mmol/L、乙二醇雙四乙酸(EGTA)5 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、Tris-磷酸肌酸 10 mmol/L、MgATP 4 mmol/L、 NaGTP 0.5 mmol/L, pH為7.3。記錄微抑制性突觸后電流(mIPSC)時(shí)，在上述記錄動(dòng)作電位的細(xì)胞外液中添加河豚毒素(TTX，1 μmol/L)、2-氨基-5-膦酰戊酸(APV，25 μmol/L)、二硝基喹酮(DNQX，20 μmol/L)，細(xì)胞內(nèi)液含CsCl 140 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、Hepes 5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgATP 2 mmol/L、NaGTP 0.3 mmol/L、QX-314 5 mmol/L。記錄微小興奮性突觸后電流(mEPSC)時(shí)，在上述記錄動(dòng)作電位的細(xì)胞外液中添加TTX 1 μmol/L、Bicuculline 20 μmol/L；內(nèi)液與上述記錄動(dòng)作電位內(nèi)液相同。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察原代神經(jīng)元及凍存神經(jīng)元復(fù)蘇培養(yǎng)后形態(tài)、成活率、動(dòng)作電位。Burst樣放電神經(jīng)元定義：持續(xù)去極化超過(guò)10 mV，在整個(gè)去極化放電過(guò)程中有連續(xù)不少于5個(gè)動(dòng)作電位發(fā)放，定義為1次Burst樣放電，10 min內(nèi)有2次及以上Burst樣放電則定義該神經(jīng)元為Burst樣放電神經(jīng)元[16]。mIPSC與整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的釋放量、抑制性突觸數(shù)目和GABA受體相關(guān)[17-18]；mEPSC與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放量、興奮性突觸數(shù)目和受體相關(guān)[19-20]。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué) 培養(yǎng)成熟的原代未凍存神經(jīng)元胞體飽滿(mǎn)，細(xì)胞周?chē)泄鈺?，?jīng)MAP2染色發(fā)現(xiàn)樹(shù)突光滑無(wú)間斷點(diǎn)(圖1)；接種2 h后可觀察到細(xì)胞貼壁；接種24 h后，神經(jīng)元伸出較長(zhǎng)的軸突，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞伸出片狀偽足進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)。無(wú)血清組和DF12+DMSO組復(fù)蘇后，神經(jīng)元的樹(shù)突和軸突生長(zhǎng)緩慢，而經(jīng)DF12+DMSO+海藻糖組復(fù)蘇后的神經(jīng)元生長(zhǎng)情況與原代未凍存海馬神經(jīng)元接近(圖2)。

2.2 海馬神經(jīng)元成活率 海馬神經(jīng)元采用不同的凍存液凍存7 d后復(fù)蘇，測(cè)定其成活率。計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，添加海藻糖的DF12+DMSO+海藻糖組成活率最高，且與無(wú)血清組有較大差異(P<0.01，圖3)。

圖1 原代未凍存海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)形態(tài)

圖2 海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)24 h軸突生長(zhǎng)情況

圖3 不同凍存液凍存7 d后細(xì)胞存活率

2.3 動(dòng)作電位發(fā)放 神經(jīng)元經(jīng)膜片鉗記錄顯示，原代未凍存海馬神經(jīng)元中有Burst樣放電的神經(jīng)元約占20%。無(wú)血清組和DF12+DMSO組神經(jīng)元中Burst樣放電神經(jīng)元占比升高(P<0.05)，DF12+DMSO組神經(jīng)元中Burst樣放電內(nèi)動(dòng)作電位頻率顯著升高(P<0.001)；而DF12+DMSO+海藻糖組神經(jīng)元中Burst樣放電神經(jīng)元占比與原代未凍存海馬神經(jīng)元接近(圖4)。

圖4 未凍存和經(jīng)凍存后的海馬神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放比較

2.4 mEPSC和mIPSC 與原代未凍存海馬神經(jīng)元相比，經(jīng)3種不同凍存液凍存過(guò)的神經(jīng)元mEPSC幅度變化均較小，頻率略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。與原代海馬神經(jīng)元相比，無(wú)血清組和DF12+DMSO組神經(jīng)元的mIPSC幅度顯著下降(P<0.001)，DF12+DMSO組神經(jīng)元的頻率顯著下降(P<0.01)；而DF12+DMSO+海藻糖組神經(jīng)元的mIPSC幅度和頻率均無(wú)明顯變化(圖6)。

3 討 論

DMSO是常用的凍存保護(hù)劑，但是DF12+(10%～20%)DMSO凍存后的海馬神經(jīng)元的電生理特性是否改變，目前鮮見(jiàn)探索。神經(jīng)元培養(yǎng)的特點(diǎn)是形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和電活動(dòng)。本研究顯示，體外分離培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元具有典型的“三角形”椎體神經(jīng)元形態(tài)，表面光滑、輪廓清晰，Burst樣放電的神經(jīng)元比例低。

圖5 原代未凍存和經(jīng)凍存后的海馬神經(jīng)元mEPSC比較

圖6 原代未凍存和經(jīng)凍存后的海馬神經(jīng)元mIPSC比較

目前，海藻糖對(duì)低溫保存細(xì)胞，例如胰島、皮膚、臍帶血、腎細(xì)胞等均表現(xiàn)出較好的保護(hù)效果[21-24]。并且，海藻糖在器官(如氣管、肺臟等)的保存中取得了滿(mǎn)意的臨床效果[25-27]。

第1次凍存神經(jīng)元是在1953年，由Luyet和Gonzales[28]完成。Paynter[29]對(duì)于各種神經(jīng)元的凍存方法進(jìn)行過(guò)總結(jié)。Fortin等[30]將凍存后的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞后進(jìn)行動(dòng)物活體移植，發(fā)現(xiàn)與未凍存細(xì)胞效果無(wú)明顯差異。有研究[31]將凍存后的內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(MGE)核團(tuán)的神經(jīng)元凍存后移植到動(dòng)物體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其能形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，且與正常GABA能神經(jīng)元形態(tài)接近。但上述研究?jī)H關(guān)注了神經(jīng)元的形態(tài)和復(fù)蘇存活率，而忽視了神經(jīng)元的電生理特性改變的可能。Seggio等[10]凍存大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元后發(fā)現(xiàn)，凍存后的DRG神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)速度與原代培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元接近。本研究也發(fā)現(xiàn)，利用無(wú)血清凍存液和DF12+10%DMSO凍存后，海馬神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)速度減慢，而利用含海藻糖的凍存液凍存后軸突生長(zhǎng)速度與原代神經(jīng)元類(lèi)似。有研究[11]用MEA記錄發(fā)現(xiàn)，皮層神經(jīng)元經(jīng)凍存后整體放電頻率與原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元類(lèi)似。本研究發(fā)現(xiàn)，用DF12+10%DMSO或凍存腫瘤細(xì)胞株常用的無(wú)血清凍存液凍存神經(jīng)元后，單個(gè)神經(jīng)元的放電特點(diǎn)和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)均改變，與原代未凍存海馬神經(jīng)元的放電特點(diǎn)有較大差異。已有文獻(xiàn)[32-33]表明，0.1 mol/L的海藻糖在動(dòng)物精子的凍存中對(duì)其具有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，添加0.1 mol/L海藻糖的凍存液凍存海馬神經(jīng)元后，神經(jīng)元的電生理特性與原代未凍存神經(jīng)元類(lèi)似，可能是由于海藻糖能使抑制性神經(jīng)元的數(shù)目減少，或?qū)ι窠?jīng)元細(xì)胞膜表面的GABA受體起保護(hù)作用，從而未誘導(dǎo)Burst樣放電產(chǎn)生。同時(shí)，本研究中DF12+DMSO+海藻糖組成活率也提高，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)與原代未凍存海馬神經(jīng)元類(lèi)似。

DMSO保護(hù)細(xì)胞的機(jī)制可能是其與水形成氫鍵改變了水變成冰的速度，同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)減少細(xì)胞脫水，使細(xì)胞免受高濃度鹽離子損傷。海藻糖不能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其保護(hù)海馬神經(jīng)元的具體機(jī)制尚不明確[34]，目前主要有2種假說(shuō)。(1)水替代假說(shuō)：海藻糖在細(xì)胞脫水時(shí)取代水分子與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層和膜蛋白結(jié)合保護(hù)其天然結(jié)構(gòu)[35]；(2)玻璃態(tài)假說(shuō)：海藻糖與鄰近分子在-30℃左右形成玻璃態(tài)，該溫度遠(yuǎn)高于DMSO形成玻璃態(tài)所需溫度，玻璃態(tài)擴(kuò)散系數(shù)低，可以使生物大分子維持比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)[36]。另有研究[37]表明，海藻糖可以抑制炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)；且星形膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源性海藻糖供神經(jīng)元利用，促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)[38]。海藻糖保護(hù)神經(jīng)元可能是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，從神經(jīng)元功能、網(wǎng)絡(luò)和成活率角度講，建議在凍存海馬神經(jīng)元時(shí)凍存液中添加海藻糖。

綜上所述，本研究采用含海藻糖的凍存液凍存原代海馬神經(jīng)元后，神經(jīng)元的電生理特性?xún)?yōu)于不含海藻糖的凍存液凍存的海馬神經(jīng)元。本研究為提高原代海馬神經(jīng)元的利用率、保存珍貴海馬神經(jīng)元標(biāo)本奠定了基礎(chǔ)。