王國祥， 劉 娟， 周志遠， 劉 旭*

1. 復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放療科，上海 200032 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200032

海馬作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，與學(xué)習(xí)、記憶、癲癇密切相關(guān)[1-3]，是神經(jīng)生物學(xué)研究的熱點。體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病常用的載體，在神經(jīng)生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用[4-6]。實驗過程中，海馬神經(jīng)元需要從胎鼠或乳鼠提取進行原代培養(yǎng)，無法像腫瘤細胞株進行體外傳代培養(yǎng)，因此無論從動物保護、動物倫理，還是盡量減少資源浪費和保存珍稀動物模型細胞樣本的角度出發(fā)，神經(jīng)元凍存后復(fù)蘇再利用都顯得尤為重要。

凍存細胞的常規(guī)操作是緩慢降溫，最后保存于-80℃冰箱或者液氮中。目前常用的冷凍保護劑有二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇和甘油等。既往研究[7-10]大多對凍存后海馬神經(jīng)元的形態(tài)進行觀察，而未檢測其電生理功能，僅Quasthoff等[11]利用多電極微陣列(MEA)進行了皮層神經(jīng)元凍存后整體神經(jīng)元放電情況觀察。海藻糖是一種非滲透性保護劑，由2個葡萄糖分子構(gòu)成，能穩(wěn)定生物膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使生物體免受氧化應(yīng)激的損傷，可應(yīng)用于多種細胞和器官凍存中[12-14]。本實驗采用無血清凍存液、DF12+10% DMSO凍存液、DF12+10% DMSO+海藻糖凍存液凍存細胞，評估其對海馬神經(jīng)元凍存復(fù)蘇后電活動的影響，為建立穩(wěn)定的原代海馬神經(jīng)元保存技術(shù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原代海馬神經(jīng)元分離與混合培養(yǎng) 采用石瑩等[15]的方法：孕18～19 d SD大鼠，經(jīng)烏拉坦深度麻醉后，剖腹取胎鼠5～6只，快速去除頭皮及顱骨，取出完整的腦組織，分離海馬并去除血管。用預(yù)熱好的0.25%胰蛋白酶消化10～15 min，期間搖勻2～3次，用含10% 磷酸鹽緩沖液(FBS)的DF12培養(yǎng)基終止消化，用經(jīng)火焰拋光的玻璃滴管吹打20次左右，直到無明顯的組織塊。離心收集細胞，接種于預(yù)先用貼壁因子多聚賴氨酸(PDL)包被過的24孔板中。培養(yǎng)后每隔3 d更換NB27培養(yǎng)基(每次均為半換液)。第14～17天進行膜片鉗檢測。

1.2 海馬神經(jīng)元冷凍保存及復(fù)蘇 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)當天，分別用無血清凍存液(無血清組)、DF12+10% DMSO(DF12+DMSO組)、DF12+10% DMSO+0.1 mol/L海藻糖(DF12+DMSO+海藻糖組)凍存。

7 d后取出凍存的海馬神經(jīng)元，快速放入37℃水浴箱中解凍，然后以1 000r/min離心5 min，除去凍存液，對收集得到的海馬神經(jīng)元計數(shù)、接種。凍存成活率定義為復(fù)蘇當日計數(shù)的海馬神經(jīng)元與原代分離的海馬神經(jīng)元數(shù)目之比。

1.3 神經(jīng)元電生理記錄 玻璃電極經(jīng)拉制后，電阻為3～5 MΩ，當電極尖端與神經(jīng)元形成GO封接后，負壓吸破細胞，隨后進行全細胞模式下電壓鉗或者電流鉗記錄。采集電流經(jīng)放大器Axonpatch 700B放大，由Digital 1440A采集后儲存。記錄動作電位時，細胞外液含NaCl 128 mmol/L、葡萄糖 30 mmol/L、Hepes 25 mmol/L、KCl 5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgCl21 mmol/L，pH為7.3；細胞內(nèi)液含K-gluconate 125 mmol/L、KCl 10 mmol/L、乙二醇雙四乙酸(EGTA)5 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、Tris-磷酸肌酸 10 mmol/L、MgATP 4 mmol/L、 NaGTP 0.5 mmol/L, pH為7.3。記錄微抑制性突觸后電流(mIPSC)時，在上述記錄動作電位的細胞外液中添加河豚毒素(TTX，1 μmol/L)、2-氨基-5-膦酰戊酸(APV，25 μmol/L)、二硝基喹酮(DNQX，20 μmol/L)，細胞內(nèi)液含CsCl 140 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、Hepes 5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgATP 2 mmol/L、NaGTP 0.3 mmol/L、QX-314 5 mmol/L。記錄微小興奮性突觸后電流(mEPSC)時，在上述記錄動作電位的細胞外液中添加TTX 1 μmol/L、Bicuculline 20 μmol/L；內(nèi)液與上述記錄動作電位內(nèi)液相同。

1.4 觀察指標 觀察原代神經(jīng)元及凍存神經(jīng)元復(fù)蘇培養(yǎng)后形態(tài)、成活率、動作電位。Burst樣放電神經(jīng)元定義：持續(xù)去極化超過10 mV，在整個去極化放電過程中有連續(xù)不少于5個動作電位發(fā)放，定義為1次Burst樣放電，10 min內(nèi)有2次及以上Burst樣放電則定義該神經(jīng)元為Burst樣放電神經(jīng)元[16]。mIPSC與整個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的釋放量、抑制性突觸數(shù)目和GABA受體相關(guān)[17-18]；mEPSC與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放量、興奮性突觸數(shù)目和受體相關(guān)[19-20]。

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)學(xué) 培養(yǎng)成熟的原代未凍存神經(jīng)元胞體飽滿，細胞周圍有光暈，經(jīng)MAP2染色發(fā)現(xiàn)樹突光滑無間斷點(圖1)；接種2 h后可觀察到細胞貼壁；接種24 h后，神經(jīng)元伸出較長的軸突，其中星形膠質(zhì)細胞伸出片狀偽足進行貼壁生長。無血清組和DF12+DMSO組復(fù)蘇后，神經(jīng)元的樹突和軸突生長緩慢，而經(jīng)DF12+DMSO+海藻糖組復(fù)蘇后的神經(jīng)元生長情況與原代未凍存海馬神經(jīng)元接近(圖2)。

2.2 海馬神經(jīng)元成活率 海馬神經(jīng)元采用不同的凍存液凍存7 d后復(fù)蘇，測定其成活率。計數(shù)發(fā)現(xiàn)，添加海藻糖的DF12+DMSO+海藻糖組成活率最高，且與無血清組有較大差異(P<0.01，圖3)。

圖1 原代未凍存海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)形態(tài)

圖2 海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)24 h軸突生長情況

圖3 不同凍存液凍存7 d后細胞存活率

2.3 動作電位發(fā)放 神經(jīng)元經(jīng)膜片鉗記錄顯示，原代未凍存海馬神經(jīng)元中有Burst樣放電的神經(jīng)元約占20%。無血清組和DF12+DMSO組神經(jīng)元中Burst樣放電神經(jīng)元占比升高(P<0.05)，DF12+DMSO組神經(jīng)元中Burst樣放電內(nèi)動作電位頻率顯著升高(P<0.001)；而DF12+DMSO+海藻糖組神經(jīng)元中Burst樣放電神經(jīng)元占比與原代未凍存海馬神經(jīng)元接近(圖4)。

圖4 未凍存和經(jīng)凍存后的海馬神經(jīng)元動作電位發(fā)放比較

2.4 mEPSC和mIPSC 與原代未凍存海馬神經(jīng)元相比，經(jīng)3種不同凍存液凍存過的神經(jīng)元mEPSC幅度變化均較小，頻率略升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。與原代海馬神經(jīng)元相比，無血清組和DF12+DMSO組神經(jīng)元的mIPSC幅度顯著下降(P<0.001)，DF12+DMSO組神經(jīng)元的頻率顯著下降(P<0.01)；而DF12+DMSO+海藻糖組神經(jīng)元的mIPSC幅度和頻率均無明顯變化(圖6)。

3 討 論

DMSO是常用的凍存保護劑，但是DF12+(10%～20%)DMSO凍存后的海馬神經(jīng)元的電生理特性是否改變，目前鮮見探索。神經(jīng)元培養(yǎng)的特點是形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和電活動。本研究顯示，體外分離培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元具有典型的“三角形”椎體神經(jīng)元形態(tài)，表面光滑、輪廓清晰，Burst樣放電的神經(jīng)元比例低。

圖5 原代未凍存和經(jīng)凍存后的海馬神經(jīng)元mEPSC比較

圖6 原代未凍存和經(jīng)凍存后的海馬神經(jīng)元mIPSC比較

目前，海藻糖對低溫保存細胞，例如胰島、皮膚、臍帶血、腎細胞等均表現(xiàn)出較好的保護效果[21-24]。并且，海藻糖在器官(如氣管、肺臟等)的保存中取得了滿意的臨床效果[25-27]。

第1次凍存神經(jīng)元是在1953年，由Luyet和Gonzales[28]完成。Paynter[29]對于各種神經(jīng)元的凍存方法進行過總結(jié)。Fortin等[30]將凍存后的神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細胞后進行動物活體移植，發(fā)現(xiàn)與未凍存細胞效果無明顯差異。有研究[31]將凍存后的內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(MGE)核團的神經(jīng)元凍存后移植到動物體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其能形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，且與正常GABA能神經(jīng)元形態(tài)接近。但上述研究僅關(guān)注了神經(jīng)元的形態(tài)和復(fù)蘇存活率，而忽視了神經(jīng)元的電生理特性改變的可能。Seggio等[10]凍存大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元后發(fā)現(xiàn)，凍存后的DRG神經(jīng)元的軸突生長速度與原代培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元接近。本研究也發(fā)現(xiàn)，利用無血清凍存液和DF12+10%DMSO凍存后，海馬神經(jīng)元的軸突生長速度減慢，而利用含海藻糖的凍存液凍存后軸突生長速度與原代神經(jīng)元類似。有研究[11]用MEA記錄發(fā)現(xiàn)，皮層神經(jīng)元經(jīng)凍存后整體放電頻率與原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元類似。本研究發(fā)現(xiàn)，用DF12+10%DMSO或凍存腫瘤細胞株常用的無血清凍存液凍存神經(jīng)元后，單個神經(jīng)元的放電特點和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)均改變，與原代未凍存海馬神經(jīng)元的放電特點有較大差異。已有文獻[32-33]表明，0.1 mol/L的海藻糖在動物精子的凍存中對其具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，添加0.1 mol/L海藻糖的凍存液凍存海馬神經(jīng)元后，神經(jīng)元的電生理特性與原代未凍存神經(jīng)元類似，可能是由于海藻糖能使抑制性神經(jīng)元的數(shù)目減少，或?qū)ι窠?jīng)元細胞膜表面的GABA受體起保護作用，從而未誘導(dǎo)Burst樣放電產(chǎn)生。同時，本研究中DF12+DMSO+海藻糖組成活率也提高，神經(jīng)元細胞形態(tài)與原代未凍存海馬神經(jīng)元類似。

DMSO保護細胞的機制可能是其與水形成氫鍵改變了水變成冰的速度，同時進入細胞內(nèi)減少細胞脫水，使細胞免受高濃度鹽離子損傷。海藻糖不能穿透細胞膜進入細胞內(nèi)，其保護海馬神經(jīng)元的具體機制尚不明確[34]，目前主要有2種假說。(1)水替代假說：海藻糖在細胞脫水時取代水分子與細胞膜的磷脂雙分子層和膜蛋白結(jié)合保護其天然結(jié)構(gòu)[35]；(2)玻璃態(tài)假說：海藻糖與鄰近分子在-30℃左右形成玻璃態(tài)，該溫度遠高于DMSO形成玻璃態(tài)所需溫度，玻璃態(tài)擴散系數(shù)低，可以使生物大分子維持比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)[36]。另有研究[37]表明，海藻糖可以抑制炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)；且星形膠質(zhì)細胞可以產(chǎn)生內(nèi)源性海藻糖供神經(jīng)元利用，促進神經(jīng)元樹突生長[38]。海藻糖保護神經(jīng)元可能是多種機制共同作用的結(jié)果，從神經(jīng)元功能、網(wǎng)絡(luò)和成活率角度講，建議在凍存海馬神經(jīng)元時凍存液中添加海藻糖。

綜上所述，本研究采用含海藻糖的凍存液凍存原代海馬神經(jīng)元后，神經(jīng)元的電生理特性優(yōu)于不含海藻糖的凍存液凍存的海馬神經(jīng)元。本研究為提高原代海馬神經(jīng)元的利用率、保存珍貴海馬神經(jīng)元標本奠定了基礎(chǔ)。