周楠 丁紅梅 楊俊

[摘要]依據(jù)《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）及《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）中不確定度評定的一般流程，對高效液相色譜法測定藍莓酵素酒中山梨酸和糖精鈉含量測量不確定度進行評定。通過建立相應(yīng)的數(shù)學模型，分析高效液相色譜法測定藍莓酵素酒中山梨酸和糖精鈉含量測量中引入的各測量不確定度分量，計算得到測量結(jié)果的合成標準不確定度和擴展不確定度。當置信度為95%，包含因子為2時，得到測量結(jié)果山梨酸擴展不確定度為0.007 6g/kg，樣品中山梨酸含量表示為（0.169 5±0.007 6）g/kg;糖精鈉擴展不確定度為0.004 9g/kg，含量測定結(jié)果可表示為（0.138 0±0.004 9）g/kg。評定結(jié)果表明，影響檢測結(jié)果不確定度的因素主要是標準工作溶液配制和儀器重復測定。本方法對高效液相色譜法測定藍莓酒中山梨酸和糖精鈉含量結(jié)果的不確定度評定具有參考作用。

[關(guān)鍵詞]不確定度;山梨酸;糖精鈉;高效液相色譜法;藍莓酵素酒

中圖分類號：TS275.4 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202008

食品添加劑作為現(xiàn)代食品工業(yè)重要組成部分，對于改善食品色、香、味、形，提高食品的質(zhì)量和檔次，防止腐敗變質(zhì)發(fā)揮著重要的作用[1]。但食品添加劑在食品加工環(huán)節(jié)超限量或者違規(guī)使用會對人體健康造成潛在危害[2]。山梨酸是一種國際公認安全的防腐劑，安全性很高，但如果山梨酸的添加量超標，消費者長期食用，在一定程度上會抑制骨骼生長，危害腎、肝臟的健康[3]。糖精鈉作為甜味劑甜度約為蔗糖的450～550倍，食用較多后，會影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使食欲減退，有致癌和致遺傳損害的可能性[4-5]。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規(guī)定山梨酸及其鉀鹽與糖精鈉在配制酒的最大允許使用量分別為0.4g/kg、0.15g/kg[6]。2011年中國合格評定國家認可委員會頒布的《測量不確定度的要求》（CNAS-CL07）指出：當不確定度與檢測結(jié)果的有效性或應(yīng)用有關(guān)、或在用戶有要求時、或當不確定度影響到對規(guī)范限度的符合性時、當測試方法中有規(guī)定時和CNAS有要求時，檢測報告必須提供測量結(jié)果的不確定度。故測量不確定度的評定對實驗室檢測的準確表示和評定具有重要意義[7]。本文參照《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[8]及《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[9]，建立測量模型，對其進行不確定度來源分析和評定，為同類項目的測定結(jié)果的不確定度評定及分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

藍莓酵素酒：市售;乙酸銨：分析純，國藥集團有限公司;甲醇：色譜純，德國Merck公司;山梨酸標準品：CAS 110-44-1，純度99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司;糖精鈉標準品：CAS 128-44-9，純度99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司;高效液相色譜儀：Agilent 1260，安捷倫科技（中國）有限公司;電子天平：BSA224S，賽多利斯科學儀器有限公司;離心機：eppendorf 5430，德國艾本德股份公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取約2g（精確到0.001g）試樣于50mL具塞離心管中，加水約25mL，渦旋混勻，于8 000r/min離心5min，將水相轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，于殘渣中加水20mL，渦旋混勻后超聲5min，于8 000r/min離心5min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22μm濾膜，待液相色譜測定。

1.2.2 標準溶液的配制

標準儲備液的配制：分別準確移取山梨酸標準品（1 000μg/mL）和糖精鈉標準品（1 000μg/mL）各1.0mL于10mL容量瓶中配制混合標準儲備液（100μg/mL）。逐步稀釋得到標準工作液質(zhì)量濃度分別為1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Shiseido Solar C18柱（150mm×4.6mm，0.5μm）;流動相：0.02mol/L 乙酸銨溶液-甲醇（95∶5，v/v）;流速：1mL/min;進樣量：10μL。

2 不確定度評定

2.1 數(shù)學模型的建立

山梨酸、糖精鈉的含量計算公式：

X=（c×v）÷（m×1 000） ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1）

式中：X為試樣中待測組分含量，g/kg;c為由標準曲線得出的試樣液中待測物的質(zhì)量濃度，mg/L;v為試樣定容體積，mL;m為試樣質(zhì)量，g。1 000是由mg/kg轉(zhuǎn)換為g/kg的換算因子。

2.2 不確定度主要來源及分析

分析測定的整個過程和數(shù)學模型，不確定度主要來源如下：

（1）稱量樣品質(zhì)量產(chǎn)生的不確定度u（m），主要包括天平校準引入u1（m）、樣品重復稱量引入不確定度u2（m）。（2）樣品處理液定容體積產(chǎn)生的不確定度u（v），主要包括溫度變化引入不確定度u1（v）、容量瓶檢定引入的不確定度u2（v）。（3）標準工作曲線產(chǎn)生的不確定度u（c）：①標準溶液制備產(chǎn)生的不確定度u1（c），包括標準物質(zhì)引入的不確定度u2（c）、量器引入不確定度u3（c），u3（c）又包括量器校準引入的不確定度u4（c）和溫度變化引入的不確定度和u5（c）;②曲線擬合產(chǎn)生的不確定度u6（c）。（4）儀器重復測量樣品產(chǎn)生的不確定度u（f），包括儀器校準引入的不確定度u1（f）和重復測量引入的不確定度u2（f）。

由于以上各不確定度分量互不相關(guān)，所以其合成相對標準不確定度如下：

urel（X）=[urel（m）2+urel（v）2+urel（c）2+urel（f）2] ? ? ? ?（2）

3 各分量標準不確定度的評定

3.1 稱量樣品引入的不確定度u（m）

3.1.1 由天平校準產(chǎn)生的不確定度

天平校準證書上允許的極差為±0.1mg，按照均勻分布考慮，包含因子k=3，因此計算標準不確定度u1（m）=0.1÷3 =5.77×10-2mg。

稱量需進行二次（一次清除稱量容器質(zhì)量，一次稱量樣品質(zhì)量），則二次稱量的標準不確定度U1（m）=[2×（0.1÷3 ?）2 ] ?=0.081 65mg，相對標準不確定度u1rel（m）=U1（m）÷m=0.081 65÷（2.011 0× 1 000）=4.060 2×10-5。

3.1.2 重復稱量產(chǎn)生的不確定度

根據(jù)檢定證書，天平的重復性誤差為0.2mg，按照均勻分布考慮，包含因子k=3，因此計算標準不確定度U2（m）=[2×（0.2÷3 ?）2] ?=0.163 30mg，相對標準不確定度u2rel（m）=U2（m）÷m=0.163 30÷（2.011 0 × 1 000）=8.120 3×10-5。

3.1.3 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度

天平稱量產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（m）=[u1rel（m）2+u2rel（m）2] =[（4.060 2×10-5）2+（8.120 3 × 10-5）2]=9.079×10-5。

3.2 定容樣品引入的不確定度u（v）

3.2.1 溫度變化引入的不確定度

樣品處理液最終定容在50mL容量瓶中，容量瓶在20℃下檢定，當實驗室溫度變化為±5℃時，代入水和玻璃的膨脹系數(shù)，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4mL/℃，而玻璃的膨脹系數(shù)為水的膨脹系數(shù)的 ? ，所以忽略不計。按照均勻分布，k=3，則U1（v）=（50×5×2.1×10-4） ÷3 ?=0.030 31mL，u1rel（v）= U1（v）÷v=6.062 4×10-4。

3.2.2 檢定引入的不確定度

根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[10]，A級的50mL單標線容量瓶的允差為±0.05mL，按照均勻分布考慮，包含因子k=3，則標準不確定度U2（v）=0.05÷3=0.028 87mL，相對標準不確定度u2rel（v）=U2（v）÷v= 5.774 0×10-4。

3.2.3 由定容體積引入的標準不確定度

樣品定容體積的標準不確定度urel（v）=[u1rel（v）2+u2rel（v）2]=[（6.062 4×10-4）2+（5.774 0× 10-4）2] =8.372×10-4。

3.3 標準工作曲線引入的不確定度u（c）

3.3.1 標準溶液配制產(chǎn)生的不確定度

標準溶液配制產(chǎn)生的不確定度u1（c）包括標準物質(zhì)引入的不確定度u2（c）、量器引入不確定度u3（c），其計算公式如下：

u1rel（c）=[u2rel（c）2+u3rel（c）2] ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （3）

3.3.1.1 山梨酸標準儲備液、糖精鈉標準儲備液產(chǎn)生的不確定度

山梨酸標準溶液（1 000μg/mL）和糖精鈉標準溶液（1 000μg/mL）證書中提供的擴展標準不確定度為3%和2%，按正態(tài)分布置信概率P=95%，包含因子k=2。使用山梨酸標準溶液產(chǎn)生相對標準不確定度為u2rel（山梨酸）=3%÷2=0.015。使用糖精鈉標準溶液產(chǎn)生相對標準不確定度為u2rel（糖精鈉）=2%÷2=0.01。

3.3.1.2 標準儲備液稀釋過程中量器引入的不確定度

量器引入不確定度u3（c）包括量器校準引入的不確定度u4（c）和溫度變化引入的不確定度和u5（c）。

標準工作溶液是由標準儲備液稀釋得到，1 000μg/mL標準溶液稀釋10倍得到100μg/mL標準儲備液，100μg/mL標準儲備液分別稀釋5倍、10倍得到20μg/mL和10μg/mL標準溶液，10μg/mL標準溶液分別稀釋2倍、10倍得到5μg/mL和1μg/mL標準溶液，20μg/mL標準溶液稀釋10倍得到2μg/mL標準溶液。在稀釋過程中分別使用到1mL單標移液管（A級）4次，2mL單標移液管（A級）1次，5mL單標線容量瓶（A級）1次，10mL單標容量瓶6次。

（1）量器校準引入的不確定度。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[10]1mL、2mL、5mL單標移液管及10mL單標容量瓶允許誤差分別為±0.007mL、±0.010mL、±0.015mL、±0.02mL，按均勻分布，包含因子k=3，則相對標準不確定度分別為u4rel（1mL）=0.007÷（3×1）=4.04×10-3;u4rel（2mL）= 0.010÷（3×2）=2.887×10-3;u4rel（5mL）=0.015÷（3× 5）=1.732×10-3;u4rel（10mL）=0.020 ÷（3×10）= 1.155×10-3。

（2）溫度變化引入的不確定度。校準過程中室溫變化為（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4mL/℃，按照均勻分布，k=3，則溫度變化引起的不確定度為u5rel（1mL）=（1×5×2.1×10-4）÷（3×1）=6.062×10-4，同理u5rel（2mL）、u5rel（5mL）和u5rel（10mL）均為6.062×10-4。

Urel=urel×k ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? （7）

則樣品相對擴展不確定度Urel（山梨酸）=0.022 5×2=4.50%，Urel（糖精鈉）=0.017 9×2=3.58%。本樣品中山梨酸含量均值為0.169 5g/kg，糖精鈉含量均值為0.138 0g/kg，因此擴展不確定度 U（山梨酸）=0.169 5g/kg×4.50%=0.007 6g/kg，U（糖精鈉）=0.138 0g/kg×3.58%=0.004 9g/kg，故樣品中山梨酸含量最終測定結(jié)果為X（山梨酸）= （0.169 5±0.007 6）g/kg（k=2），糖精鈉含量最終測定結(jié)果為X（糖精鈉）=（0.138 0±0.004 9）g/kg（k=2）。

4 結(jié) 論

根據(jù)國標方法測定酒類樣品前處理方法較為簡單，因為樣品均勻程度高，無需沉淀蛋白，基本無不溶性固性物，所以樣品前處理步驟不確定度主要來自樣品的稱量和樣液的定容。通過不確定的評定過程可以得出，稱量和樣液的定容對整個試驗的不確定度影響較小。本試驗主要的不確定度來自標準工作曲線和儀器重復測定樣品。其中，影響標準曲線不確定度的主要因素是標準曲線溶液的配制，標準物質(zhì)不確定度對標準曲線溶液配制不確定度影響較大，實際操作過程中應(yīng)選擇準確度等級較高的標準品，嚴格把控標準物質(zhì)的保存溫度、保存環(huán)境，并對開封后保質(zhì)期內(nèi)的標準物質(zhì)進行期間核查。同時注重儀器的維護保養(yǎng)，并定期進行儀器期間核查和儀器檢定，保持儀器運行的良好狀態(tài)，通過增加平行樣測定次數(shù)，降低測量的不確定度，從而提高測定結(jié)果的準確性，減少測定結(jié)果的不確定度。

參考文獻

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