趙楠，穆春青，王紅，王秋寧，才志陽

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室；3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥品管理科，遼寧 錦州 121000)

肺癌分類中以非小細(xì)胞癌最為常見[1]，且發(fā)現(xiàn)時(shí)常常已處于晚期，治療晚期非小細(xì)胞癌的一線藥物為鉑類藥物，但長(zhǎng)時(shí)間使用此類藥易導(dǎo)致機(jī)體的耐藥性。文獻(xiàn)表明，很多中藥成分可以單獨(dú)或聯(lián)合鉑類藥物治療肺癌，減少腫瘤轉(zhuǎn)移或增殖[2-4]。雷公藤紅素是雷公藤中一種天然化合物，除具有抗炎作用外，還可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[5-6]。自噬是一種真核細(xì)胞維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的特殊機(jī)制，是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的過程，生理狀態(tài)下自噬可以清除體內(nèi)受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)[7-8]。近年來，自噬現(xiàn)象在不同腫瘤中被廣泛觀察到，有研究表明自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著“雙面”作用[9]，它既可以在適當(dāng)?shù)臈l件下通過減少有害因素保護(hù)腫瘤細(xì)胞[10-11]，又可以在過度作用時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡[12-14]。有文獻(xiàn)表明，雷公藤紅素可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而抑制多種腫瘤細(xì)胞如宮頸癌、前列腺癌、骨肉瘤等的增殖或遷移[15-17]。但雷公藤紅素對(duì)A549肺癌細(xì)胞的增殖及自噬的相關(guān)研究相對(duì)較少，故本研究主要探討雷公藤紅素對(duì)A549肺癌細(xì)胞的增殖及自噬的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人肺癌細(xì)胞A549由錦州醫(yī)科大學(xué)王秋寧老師提供；MTT購自納川公司；雷公藤紅素購自鴻汲康潤(rùn)生物醫(yī)藥公司；結(jié)晶紫購自碧云天生物技術(shù)公司；Trizol購自invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR熒光定量購自銳博生物科技有限公司；β-actin、LC3B、P62、Beclin 1基因引物購自上海生工；蛋白提裂解液、BCA測(cè)定試劑盒、凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人一抗β-actin、LC3B、P62、Beclin 1購自萬類生物科技公司；HRP羊抗兔二抗購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇細(xì)胞，加入含有雙抗(100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，傳5代后取對(duì)數(shù)期細(xì)胞實(shí)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

于96孔板每孔接種約5×104個(gè)細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中24 h待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定，次日分別應(yīng)采用0、1、2、3、4、5和6 μmol/L雷公藤紅素處理A549細(xì)胞0、24、48、72 h。配制MTT溶液，取出96孔培養(yǎng)板，在所需檢測(cè)孔中加入20 μL MTT溶液培養(yǎng)4 h，后吸掉培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，讀取490 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組。

1.2.3 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)細(xì)胞集落形成

于12孔板每孔接種約1×103個(gè)細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中24 h待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定，次日分別采用0、1、3 μmol/L雷公藤紅素處理A549細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)7 d，取出12孔板棄培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗1遍，用4%多聚甲醛固定約10 min，三蒸水沖洗3遍，再用結(jié)晶紫染色10 min，三蒸水沖洗干凈拍照。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)LC3B、P62、Beclin 1的mRNA水平

雷公藤紅素0、1、3 μmol/L處理細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)液PBS清洗3次，Trizol法提出總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存。15 μL PCR反應(yīng)總體系：7.5 μL SYBR+5.9 μL水+1 μL cDNA+0.6 μL引物，反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；40×(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s)。引物序列如下：β-actin正向引物為5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物為5′- CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′；LC3B正向引物為5′-AAGAGTGGAAGATGTCCGGC3′，反向引物為5′-TGCAAGCGCCGTCTGATTA-3′；P62正向引物為5′-AGTCTCTGGCGGAGCAGATGA-3′，反向引物為5′-TCTGGCATCTGTAGGGACTGGA-3′；Beclin 1正向引物為5′-ATCTAAGGAGCTGCCGTTATAC-3′，反向引物為5′-CTCCTCAGAGTTAAACTGGGTT-3′。

1.2.5 Western blot檢測(cè)LC3B、P62、Beclin 1蛋白水平

雷公藤紅素0、1、3 μmol/L處理細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)液PBS清洗2～3次，提取蛋白并測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣量為30 μg。根據(jù)蛋白分子量配制相應(yīng)濃度的凝膠，后將蛋白條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉液室溫封閉2 h，后加入一抗冷庫過夜，次日TBST漂洗2～3次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗2～3次后呈像定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗(yàn)，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雷公藤紅素可以抑制A549細(xì)胞增殖

雷公藤紅素0、1、2、3、4、5、6 μmol/L處理A549細(xì)胞，隨著濃度與時(shí)間增強(qiáng)，細(xì)胞增殖抑制作用越明顯。根據(jù)不同濃度及時(shí)間對(duì)細(xì)胞數(shù)量及生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度選用0、1、3 μmol/L，處理時(shí)間選擇48 h。

2.2 雷公藤紅素可以抑制A549細(xì)胞集落形成

雷公藤紅素0、1、3 μmol/L處理細(xì)胞7 d，與0 μmol/L組比較，經(jīng)1、3 μmol/L處理的A549細(xì)胞集落形成顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

表1 細(xì)胞增殖率比較

圖1 雷公藤紅素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

注：aP<0.05 vs 0 μmol/L雷公藤紅素；cP<0.05 vs 1 μmol/L雷公藤紅素

表2 各組細(xì)胞集落數(shù)量比較

2.3 雷公藤紅素可以上調(diào)A549細(xì)胞LC3B、Beclin 1、P62的mRNA水平

雷公藤紅素0、1、3 μmol/L處理細(xì)胞48h，與0 μmol/L組比較，經(jīng)1、3 μmol/L處理的A549細(xì)胞中LC3B、Beclin 1的mRNA水平顯著升高，經(jīng)3 μmol/L處理的A549細(xì)胞中P62的mRNA水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

注：aP<0.05 vs 0 μmol/L雷公藤紅素；cP<0.05 vs 1 μmol/L雷公藤紅素

2.4 雷公藤紅素可以上調(diào)A549細(xì)胞LC3B、Beclin 1的蛋白表達(dá)水平、降低P62的蛋白表達(dá)水平

雷公藤紅素0、1、3 μmol/L處理細(xì)胞48 h，與0 μmol/L組比較，經(jīng)1、3 μmol/L處理的A549細(xì)胞中LC3B、Beclin 1蛋白水平顯著升高；P62 蛋白水平顯著降低，見圖4。

表3 PCR檢測(cè)中LC3B、Beclin 1及P62蛋白表達(dá)水平

注：aP<0.05 vs 0 μmol/L雷公藤紅素；cP<0.05 vs 1 μmol/L雷公藤紅素

表4 Western blot檢測(cè)中LC3B、Beclin 1及P62蛋白表達(dá)水平

3 討 論

近年來研究顯示，雷公藤紅素不僅具有抗炎、抗氧化等作用，還可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。自噬是一種II型程序性細(xì)胞死亡，很多研究表明自噬與腫瘤的發(fā)展存在密切關(guān)系，自噬對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言，雖然具有“雙面”作用，但許多研究表明，誘導(dǎo)自噬可以抑制腫瘤的發(fā)展[18-20]。近些年，雷公藤紅素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制已經(jīng)得到了充分的證實(shí)，但其對(duì)A549肺癌細(xì)胞的作用尚無太多文獻(xiàn)報(bào)道，故本研究首先采用MTT方法，通過查閱雷公藤紅素對(duì)其他腫瘤的作用濃度[21-23]，初步選用0、1、2、3、4、5、6 μmol/L的雷公藤紅素作用于A549細(xì)胞24 h、48 h和72 h，從而檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可濃度/時(shí)間依賴性抑制A549細(xì)胞增殖。在確定雷公藤紅素可以抑制A549細(xì)胞增殖后，選取3種濃度0、1、3 μmol/L和處理時(shí)間(48 h)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度及時(shí)間。采用結(jié)晶紫染色法觀察藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞集落的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增大，活細(xì)胞數(shù)量顯著減少，這進(jìn)一步證實(shí)了雷公藤紅素可以抑制A549腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞死亡。目前，許多研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)雷公藤紅素可以抑制或誘導(dǎo)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的自噬作用，從而對(duì)細(xì)胞的生存及生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響，但卻較少有雷公藤紅素對(duì)A549細(xì)胞中自噬作用的研究，所以本研究選取自噬相關(guān)指標(biāo)Beclin 1、LC3B及P62[24-26]，通過對(duì)其基因及蛋白水平結(jié)果的分析，進(jìn)而探討雷公藤紅素對(duì)A549細(xì)胞的自噬影響。Beclin 1作為自噬體形成過程中的關(guān)鍵蛋白，它可以促使自噬體膜的形成進(jìn)而誘導(dǎo)自噬[27-28]。LC3是公認(rèn)的自噬標(biāo)記物，LC3B作為其中的一種蛋白，它的表達(dá)與自噬誘導(dǎo)相關(guān)，也是自噬體形成的標(biāo)志。P62是一種泛素結(jié)合蛋白，可以反映自噬活性，當(dāng)過度自噬時(shí)P62蛋白被降解，反之則不斷累積。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)雷公藤紅素處理A549細(xì)胞后，Beclin 1和LC3B的mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高；P62 mRNA表達(dá)水平升高，但最終蛋白表達(dá)降低，這可能是由于在自噬增強(qiáng)時(shí)，P62的表達(dá)原本也是增多的，但由于自噬發(fā)生時(shí)蛋白降解速度快，所以在進(jìn)行蛋白檢測(cè)時(shí)是降低的，mRNA檢測(cè)時(shí)是增多的[29-31]。綜合以上結(jié)果表明，雷公藤紅素可以增強(qiáng)A549細(xì)胞的自噬活性。雖然本研究結(jié)果與部分雷公藤紅素對(duì)腫瘤細(xì)胞的自噬作用結(jié)果相似，但尚不能確定A549細(xì)胞增殖抑制與自噬增強(qiáng)之間的關(guān)系，故雷公藤紅素對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制與自噬增強(qiáng)的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了雷公藤紅素可以抑制A549細(xì)胞增殖，并初步證實(shí)雷公藤紅素可以促進(jìn)A549細(xì)胞的自噬，但自噬的增強(qiáng)對(duì)A549細(xì)胞的具體作用有待進(jìn)一步研究。