謝 鑫 陳美晴 王 勇 蔣君梅 任明見

（貴州大學農(nóng)學院 貴州·貴陽 550025）

蛋白是生物體行使其物理、化學特性和功能的重要基礎(chǔ)。大腸桿菌原核表達系統(tǒng)是開發(fā)最早、應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。它通過將克隆的目的基因插入原核表達載體，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，再通過誘導表達、純化，獲得目的蛋白。[1]原核表達技術(shù)具有遺傳背景清楚、生長速度快周期短、蛋白表達水平高、抗污染能力強、可大規(guī)模培養(yǎng)、成本低、易操作、蛋白表達載體種類多、適用范圍廣等特點，是重組蛋白表達的理想系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達。[2-4]但原核表達的效率易受到誘導菌株類型、誘導溫度范圍、誘導劑濃度等因素的影響。[5]隨著遺傳學、分子生物學和蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，對重組功能性蛋白質(zhì)的市場需求急劇增加，首要條件就是要獲得大量表達蛋白（高度純化且折疊正確的蛋白質(zhì)），[6]為實現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的商業(yè)化和其功能及相互作用進行系統(tǒng)分析。但獲取大量高純度蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性研究和生物技術(shù)產(chǎn)品開發(fā)中經(jīng)常會成為瓶頸現(xiàn)象，嚴重限制蛋白功能性的后續(xù)研究，所以蛋白質(zhì)的表達技術(shù)是必不可少的。

近年來，原核表達技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析、抗體生產(chǎn)、蛋白質(zhì)相互作用等方面。[7]運用該技術(shù)可以提供足夠的人工抗原，用于蛋白質(zhì)的快速鑒定和結(jié)構(gòu)分析。隨著對基因功能學研究的不斷深入，越來越多的實驗室也在嘗試用原核細胞表達蛋白。本次開放教學實驗對原核表達技術(shù)在本科教學中進行探索，并對蛋白可溶性表達條件進行優(yōu)化，以提高蛋白表達效率。

為了提高學生對原核表達技術(shù)的理解和掌握，更加直觀清晰地了解原核表達技術(shù)，幫助他們深入了解相關(guān)的分子生物學和基因工程類實驗的原理和操作程序。我們以高粱14-3-3 基因家族中的SbGF14c 基因為實驗材料開展本次實驗教學。預期本次教學經(jīng)驗可在校內(nèi)及其它高校進行推廣。

1 教學內(nèi)容

本次開放課程的教學內(nèi)容是“利用原核表達技術(shù)表達外源蛋白SbGF14c”。首先讓同學查找該蛋白的相關(guān)信息，分析其氨基酸序列、物理化學特性、蛋白結(jié)構(gòu)等，了解原核表達技術(shù)的步驟，在老師的幫助下學生自主設(shè)計實驗；其次，在原核表達中，蛋白通常以包涵體的形式存在于沉淀中，如何讓蛋白在細胞上清中以可溶性形式表達是原核表達中面臨的技術(shù)難題。本次實驗學生通過自己手動設(shè)計實驗完成蛋白的原核表達，得到可溶性表達蛋白；最后，采用Western blot技術(shù)對重組蛋白的表達進行鑒定。通過本次實驗可加深學生對原核表達方法的理解，同時鍛煉了學生的動腦思考、獨立設(shè)計、動手操作、分析結(jié)果和總結(jié)歸納的能力。本次實驗的主要內(nèi)容有目的基因的PCR擴增、重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化表達菌株、蛋白可溶性表達條件篩選及重組蛋白鑒定。

表1 教學內(nèi)容安排

本次教學共分4 個小組，3 個人一組。教學內(nèi)容安排如表1。

2 教學效果

在本次開放實驗中，我們把目的基因的克隆、原核表達載體構(gòu)建、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、蛋白可溶性表達以及蛋白檢測作為一個完整的教學實驗，讓學生學習從目的基因的克隆到蛋白原核表達及檢測完整流程。從實驗結(jié)果可以看出，用12% SDSPAGE 電泳檢測到目的蛋白的表達（不同菌株、溫度、IPTG 濃度），以及用Western blot 進一步證實所表達的蛋白，讓學生通過實際操作更加直觀的看到實驗結(jié)果，加強了對蛋白原核表達技術(shù)（背景、原理、步驟）的理解和掌握，同時在實驗過程中也激發(fā)了學生對蛋白表達的學習興趣，解決學生心中對蛋白原核表達的疑惑。因此，本次實驗教學是本科生物類專業(yè)中一個非常值得推廣的實驗教學，具體體現(xiàn)在以下幾個方面：

（1）增強學生對蛋白序列和原核表達技術(shù)的理解。本次教學實驗，讓學生參與實驗設(shè)計，利用在線資源自主設(shè)計實驗步驟并進行驗證，在此過程中學生學會了使用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫查詢蛋白序列及蛋白性質(zhì)的相關(guān)信息。在信息高速發(fā)展的今天，本課程結(jié)合生物信息學基礎(chǔ)，使學生更加直觀的了解基因和蛋白，這也是本實驗教學改革的主要目標之一。

（2）通過實驗操作鍛煉學生的動手和分析能力。在實驗過程中需控制菌液濃度OD600=0.5，使細菌處于最適外源蛋白表達狀態(tài)，有的同學對菌液OD 值把握不準，需在實驗中進行多次探索，積累經(jīng)驗；有的同學在做細菌轉(zhuǎn)化實驗時，沒有轉(zhuǎn)化子長出來，與小組成員及老師一起探討失敗原因或與實驗成功的同學交流學習，總結(jié)教訓；有的同學在做SDSPAGE 電泳轉(zhuǎn)膜實驗時，遇到?jīng)]有條帶，與大家共同商討出錯原因等等。這些問題的解決更加說明在本科階段很有必要設(shè)立諸如這類動手能力強的實驗課程，加強學生的實際操作能力。

（3）本次實驗教學適合推廣學習。本次實驗教學屬于分子生物學、生物化學范疇。對于只知理論未進行實際操作的同學具有實際意義。對于生物類專業(yè)的同學，學校具備相關(guān)的實驗設(shè)備，更應(yīng)該開設(shè)該課程。此外，對于不同的教學環(huán)境可以根據(jù)自身條件進行適當調(diào)整實驗內(nèi)容，希望原核表達實驗的推廣能夠使更多的學生受益。

3 教學總結(jié)

（1）在本次開放實驗教學中，將目的基因的克隆、構(gòu)建原核表達載體、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、原核表達、Western blot 驗證原核表達蛋白，作為較完整的原核表達的綜合實驗，有利于學生掌握和理解基因克隆、蛋白表達及檢測的實驗技術(shù)和原理。

（2）蛋白表達和Western blot 是目前生物學研究中應(yīng)用最廣泛的實驗技術(shù)，通過實驗教學使學生熟練掌握這些實驗技術(shù)和各種實驗儀器的使用，為將來從事科學研究打下堅實的基礎(chǔ)。

（3）本次教學中，由于實驗課時的限制，實驗均在周末進行。為達到更好的教學效果，教學要求實驗過程不僅要高效還要省時直觀，讓學生一目了然。此外，今后還需進一步增加多樣化教學方式，充分調(diào)動學生的積極性，學生在實驗中收獲到成就感，興趣和積極性便自然提高，這樣教學效果、教學質(zhì)量會更好。這些是我們今后進一步改進的方向。

（4）本次教學為課堂教學提供了基礎(chǔ)，有利于學生在課堂教學后回顧本次實驗教學，最終達到融會貫通。