頓仕杰

（天津職業(yè)大學(xué)，天津 300410）

雷蘑（Clitocybe gigantean），又稱為大白樁蘑、青腿子，白色，可食用，子實(shí)體較大，質(zhì)地肥厚，味道鮮美[1]。具備較大的藥用價(jià)值，可對(duì)麻疹患兒進(jìn)行輔助治療，并且能夠緩解傷風(fēng)感冒、煩躁不安等癥狀，可以形成杯傘素（Clitocybin），具備良好的抗肺結(jié)核效果[2]，并且具備較高的抗疲勞作用[3]。試驗(yàn)以雄性小鼠為對(duì)象分析雷蘑胞外多糖對(duì)抗疲勞的效果，探索其對(duì)運(yùn)動(dòng)恢復(fù)的作用。真菌多糖作為一種國(guó)際公認(rèn)的生理機(jī)能調(diào)節(jié)劑，具有豐富多彩的生物活性，而且毒副作用較少，對(duì)正常細(xì)胞的影響很小，與其他藥物具有協(xié)同增效作用，同時(shí)可對(duì)抗不良反應(yīng)等特點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)、國(guó)外學(xué)者在深層發(fā)酵胞外多糖研究領(lǐng)域做了不少工作，但是對(duì)雷蘑胞外多糖抗疲勞作用的研究國(guó)內(nèi)外仍屬空白。

1 材料與試驗(yàn)方案

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

本試驗(yàn)所用菌種為雷蘑（Clitocybe gigantean）AS 5.105，試驗(yàn)開(kāi)始之前購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體發(fā)酵培養(yǎng)基由土豆汁200 g、葡萄糖40 g、酵母膏 2 g，KH2PO33.0 g、MgSO4·7H20 1.5 g，VB1150 mg組成；斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

120只雄性清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18 g～22 g，來(lái)源于蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，動(dòng)物編號(hào)醫(yī)動(dòng)字第011號(hào)。動(dòng)物試驗(yàn)室保持良好的清潔狀態(tài)，相對(duì)濕度40%～65%，溫度24℃～26℃。

1.2 儀器與藥品

COBAS MIRA全自動(dòng)生化分析儀，瑞士ROCHE公司；RE 52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海青浦滬西儀器廠；1710血乳酸測(cè)定儀，日本京都公司；UV-54紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日本島津公司。自制小鼠游泳水箱規(guī)格是100 cm×50 cm×50 cm。胞外粗多糖制劑來(lái)自上海潤(rùn)裕生物科技有限公司。其余試驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 胞外粗多糖提取及溶液制備

在1 000 mL三角瓶?jī)?nèi)置入200 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，將斜面試管菌種接種在上面，第4天的將其轉(zhuǎn)接到含有6 L液體發(fā)酵培養(yǎng)基10 L種子罐中，繼續(xù)發(fā)酵4 d結(jié)束。以3 500 r·min-1離心15 min，取上清液備用；80℃的條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮至原體積1/5時(shí)，用透析技術(shù)對(duì)上清濃縮液除去還原糖；再濃縮回原體積，離心除去不溶物，4℃的條件下用95%乙醇靜置12 h處理，并取沉淀，以無(wú)水乙醇進(jìn)行3次洗滌，經(jīng)冷凍干燥處理之后獲得胞外粗多糖（CEP）[5]。

對(duì)胞外粗多糖進(jìn)行處理得到母液10 mg·mL-1，稀釋之后可以獲得設(shè)定濃度的溶液。采用間歇滅菌方式完成溶液的滅菌處理，3 500 r·min-1離心5 min，獲得上清液。

1.3.2 動(dòng)物分組和預(yù)處理

120只正常生長(zhǎng)的小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境及相關(guān)條件進(jìn)行3 d的適應(yīng)，之后將小鼠隨機(jī)均分為4組，每組30只，運(yùn)用t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠體重的組間差異不明顯，達(dá)到試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。采取攝食及飲水自由的方式，并且關(guān)照時(shí)間也是根據(jù)自然規(guī)律進(jìn)行控制，在稱重處理之后進(jìn)行給樣處理。冷凍干燥的胞外粗多糖（CEP）劑量組包括劑量300組300 mg·kg-1·d-1、劑量 200 組 200 mg·kg-1·d-1、劑量 100組100 mg·kg-1·d-1。此 3組每天早晨每鼠灌胃 0.5 mL胞外粗多糖1次。對(duì)照組以等量0.9%生理鹽水進(jìn)行灌胃處理。小鼠接受28 d喂養(yǎng)后，展開(kāi)游泳試驗(yàn)，對(duì)有關(guān)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并且針對(duì)參數(shù)的具體影響進(jìn)行評(píng)估。

1.3.3 負(fù)重游泳試驗(yàn)

每組抽取小鼠10只，最后1次給藥0.5 h之后，在與尾尖之間距離是1 cm的位置，以5 cm長(zhǎng)細(xì)棉線將小鼠體重5%的鉛絲系在小鼠上，并且在（30±1）℃的水箱中強(qiáng)迫小鼠進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)，并且水箱規(guī)格設(shè)置為100 cm×50 cm×50 cm。用秒表詳細(xì)記錄小鼠從開(kāi)始游泳到最終力竭沉入水底的用時(shí)及相關(guān)表現(xiàn)。

1.3.4 血尿素氮（BUN）含量測(cè)定

在各組中分別隨機(jī)抽取小鼠10只，最后1次給藥0.5 h后，在（30±1）℃的水箱內(nèi)強(qiáng)迫小鼠進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)，1.5 h后將其取出，以摘眼球的方式采集血液，并且進(jìn)行離心處理后取血清，檢測(cè)血尿素氮含量。

1.3.5 肝糖原測(cè)定

取1.3.4處理后的小鼠肝臟，用生理鹽水漂洗，以濾紙使其干燥；稱取100 mg，在8 mL 5%的TCA內(nèi)，進(jìn)行勻漿處理；3 000 r·min-1離心5 min后取上清液1 mL，將其添加至4 mL 95%乙醇內(nèi)，并且有效混勻，直到界面消失之后，進(jìn)行12 h的沉淀處理后；經(jīng)離心處理后將上清液去除，以重蒸水2 mL將其充分溶解，并將其轉(zhuǎn)移到規(guī)格是10 mL比色管內(nèi)；于標(biāo)準(zhǔn)管內(nèi)添加1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL及重蒸水1.5 mL，空白管內(nèi)添加2 mL重蒸水，把比色管放在冰水浴處理，添加蕙酮試劑10 mL，充分混合后，放至室溫，100℃水浴處理15 min；之后采取冰水浴處理，放至常溫之后，充分混合，以紫外分光光度計(jì)于620 nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)[6]。

1.3.6 血乳酸（BLA）測(cè)定

抽取小鼠10只，最后1次給藥0.5 h后，將小鼠體重5%的鉛皮系在小鼠身上，在（30±1）℃的水箱內(nèi)強(qiáng)迫小鼠進(jìn)行10 min的游泳運(yùn)動(dòng)。在游泳開(kāi)始之前及結(jié)束后即刻、結(jié)束后20 min的時(shí)候，于眼內(nèi)毗靜脈叢進(jìn)行血液采集，采集的量是20 μL，并將其添加到40 μL破膜液內(nèi)，充分搖勻。借助乳酸測(cè)定儀進(jìn)行LA水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

在數(shù)據(jù)分析時(shí)運(yùn)用SPSS 15.0，并且以SSR技術(shù)進(jìn)行組間對(duì)比分析及組內(nèi)對(duì)比分析，結(jié)果采用（±s）表示。

2 結(jié)果分析

2.1 胞外粗多糖對(duì)小鼠相對(duì)生長(zhǎng)率的影響

胞外粗多糖對(duì)小鼠體重及相對(duì)生長(zhǎng)率的影響情況見(jiàn)表1。

表1 胞外粗多糖對(duì)小鼠體重及相對(duì)生長(zhǎng)率的影響情況Tab.1 Effects of extracellular polysaccharides on body weight and relative growth rate of mice

由表1可知，雷蘑AS5.105胞外粗多糖會(huì)干預(yù)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力及抗疲勞水平，小鼠的相對(duì)生長(zhǎng)率也會(huì)受其影響。雷蘑AS5.105胞外粗多糖對(duì)始重、終重量無(wú)顯著影響，并且相對(duì)生長(zhǎng)率也并未存在明顯的變化（P＞0.05）。

2.2 負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果。

雷蘑胞外粗多糖對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響，具體情況見(jiàn)表2。

表2 胞外粗多糖對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響Tab.2 Effects of extracellular polysaccharides on swimming time in mice

由表2可知，劑量100組與對(duì)照組差異不明顯，而劑量200組、劑量300組游泳時(shí)長(zhǎng)差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明劑量依賴性相對(duì)較高。由于游泳時(shí)長(zhǎng)能夠直接體現(xiàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)疲勞情況，說(shuō)明雷蘑AS 5.105胞外粗多糖可以讓小鼠對(duì)運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性得到強(qiáng)化，能顯著加強(qiáng)耐力及運(yùn)動(dòng)能力，E200組、E300組的抗疲勞效應(yīng)顯著。

2.3 肝糖原、血尿素氮測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

雷蘑胞外粗多糖對(duì)肝糖原和血尿素氮含量的影響見(jiàn)表3。

表3 胞外粗多糖對(duì)肝糖原和血尿素氮的影響Tab.3 Effects of extracellular crude polysaccharides on liver glycogen and BUN

由表3可以看出，小鼠游泳后，肝糖原水平會(huì)提高、血清尿素氮含量提升程度降低。E100組與對(duì)照組的血清尿素氮含量相比差異很小，E200組、E300組血清尿素氮含量較對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，肝糖原含量在3個(gè)試驗(yàn)組中顯著提升，并且試驗(yàn)組和對(duì)照組相比的差異顯著（P＜0.01）。這就表明雷蘑AS 5.105胞外粗多糖可以提高血糖與肌糖原水平。機(jī)體的能量代謝失衡現(xiàn)象能被有效緩解，對(duì)蛋白質(zhì)過(guò)量分解的問(wèn)題也能有效解決，疲勞問(wèn)題也能因此顯著改善。

2.4 血乳酸測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

不同劑量胞外粗多糖對(duì)游泳小鼠血乳酸比值的影響情況見(jiàn)表4。

表4 胞外粗多糖對(duì)游泳小鼠血乳酸比值的影響Tab.4 Effects of extracellular polysaccharides on blood lactic acid ratio in swimming mice

由表4可以看出，E100組血乳酸含量與對(duì)照組相比差異較小（P＞0.05）。而E200組、E300組會(huì)在很大程度上出現(xiàn)抑制小鼠運(yùn)動(dòng)結(jié)束之后血乳酸水平提升的現(xiàn)象，有助于運(yùn)動(dòng)之后血乳酸水平的降低，劑量依賴性非常顯著（P＜0.05）。雷蘑胞外粗多糖能夠使得有氧代謝能力顯著強(qiáng)化，可以使得游泳運(yùn)動(dòng)之后小鼠機(jī)體內(nèi)形成的乳酸水平得到有效下降，有效緩解運(yùn)動(dòng)疲勞癥狀。

3 討論與結(jié)論

在運(yùn)動(dòng)期間，糖、脂肪分解代謝獲得的能量并不能達(dá)到機(jī)體所需，蛋白質(zhì)會(huì)分解代謝并因此完成能量供給，能夠?yàn)闄C(jī)體供給大概5%～10%能量，進(jìn)而使得糖原供給缺乏的癥狀得到改善[7]。劑量200組、劑量300組運(yùn)動(dòng)后，血尿素氮水平明顯降低，出現(xiàn)此種現(xiàn)象的主要是因?yàn)槟芰看x問(wèn)題得到了有效解決，糖、脂肪在運(yùn)動(dòng)期間的能量供給得到了加強(qiáng)，這就會(huì)使得肌肉內(nèi)蛋白質(zhì)供給能量的比重得到提升，而肌肉中能量失衡的現(xiàn)象也能因此得到改善，機(jī)體也能更好地強(qiáng)化對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)性，以此促進(jìn)得了疲勞的消除。

糖原是機(jī)體細(xì)胞存儲(chǔ)糖分的有效形式，可以有效調(diào)控機(jī)體內(nèi)的血糖水平，若是患者的血糖水平相對(duì)較高，就能夠促進(jìn)肝糖原的合成；若是血糖水平相對(duì)較低，就能夠促進(jìn)肝糖原的分解，并因此提升血糖水平[8]。此外，糖原是運(yùn)動(dòng)過(guò)程中能量的關(guān)鍵性來(lái)源[9]，所以，將糖原儲(chǔ)備量提升，能夠使得機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力及耐力顯著強(qiáng)化，有效緩解疲勞[10]。小鼠游泳后，肝糖原水平會(huì)提高、血清尿素氮含量提升程度降低，這就表示雷蘑AS 5.105胞外粗多糖可以提高血糖與肌糖原水平，機(jī)體的能量代謝失衡現(xiàn)象能有效緩解，對(duì)蛋白質(zhì)過(guò)量分解的問(wèn)題有效解決，疲勞問(wèn)題也能因此顯著改善。

綜上所述，雷蘑AS 5.105胞外粗多糖能夠使得小鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)顯著延長(zhǎng)，可以減小血乳酸及血清尿素氮水平降低，促進(jìn)機(jī)體中肝糖原儲(chǔ)備水平的提升，改善疲勞癥狀。