馬 健，楊俊杰

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000）

指紋圖譜是中藥化學(xué)研究中鑒定和評(píng)價(jià)中藥或其各組分真實(shí)性、藥性、穩(wěn)定性的重要手段。利用紅外光譜指紋特性，既不必對(duì)中藥各組分的精準(zhǔn)分析，也不必對(duì)中藥各組分結(jié)構(gòu)進(jìn)行清楚呈現(xiàn)。直接以穩(wěn)定、實(shí)用且針對(duì)性強(qiáng)的方法對(duì)中藥各組分進(jìn)行指紋特性呈現(xiàn)，相較于前兩種方法則更為精準(zhǔn)，也更具說服力[1]。由于紅外光譜具有顯著的宏觀指紋特性，且藥材化學(xué)組成的差異性決定了不同藥材呈現(xiàn)出的整體紅外光譜圖具有顯著差異，因而可以通過對(duì)中藥各組分圖譜信息疊加來實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材的組分、質(zhì)量、藥性、真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別和判定[2]。在紅外指紋圖譜相關(guān)研究方面，孫素琴、詹澤蘋、李華等進(jìn)行了大量的研究，孫素琴指出在進(jìn)行多組分中藥鑒定上要特別注意同類官能團(tuán)的進(jìn)一步鑒定[3]；詹澤蘋等則在蛹蟲草（繁育品和野生品）和偽蟲草（蟲草花等）紅外指紋圖譜研究上對(duì)比其相似度，并對(duì)其一階導(dǎo)數(shù)圖譜與二階導(dǎo)數(shù)圖譜疊加對(duì)比，進(jìn)一步確立蟲草等多組分中藥鑒定和質(zhì)量控制體系[1]；王瑞華對(duì)蛹蟲草紅外指紋圖譜的研究在一定程度上完善了蛹蟲草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)，為我國(guó)中藥質(zhì)量控制實(shí)現(xiàn)有效化、全面化、科學(xué)化提供重要理論依據(jù)[2]。

蛹蟲草又稱北冬蟲夏草、北蟲草、北蛹蟲草，是一種通過異宗配合有性生殖的子囊菌（Ascomycotina）[4]，具有區(qū)別于其他蟲草的顯著形態(tài)特征：其寄生蛹體的頭部或節(jié)部往往單生或數(shù)個(gè)子座并生，且色鮮明艷麗，常為橘黃或橘紅，蛹體則呈紫色[5]。《新華本草綱要》稱其“味甘，性平”，是為益腎補(bǔ)陽(yáng)、止血化痰等良藥[6]；現(xiàn)代醫(yī)療化學(xué)系統(tǒng)通過大量實(shí)驗(yàn)和研究，明確了蛹蟲草含有蟲草素、蟲草甾醇和糖醇類成分、蟲草多糖、蟲草多肽和無機(jī)元素成分、凝集素、纖維蛋白溶解酶、超氧化歧化酶、類胰島素蛋白、黃酮類物質(zhì)、胡蘿卜素等多種活性成分，證實(shí)了蛹蟲草的確具有以上兩大功效外，還具有珍貴的藥用價(jià)值[7]。

蛹蟲草雖然是世界性分布，但其天然資源緊缺，于是人工培育、養(yǎng)殖的蛹蟲草成為藥用蛹蟲草重要來源，但是不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)、不同采收部位、不同儲(chǔ)存時(shí)間、不同加工炮制方法的蛹蟲草藥用成分及藥性有很大差異[8]。因而科學(xué)化、精準(zhǔn)化、便捷化的藥性鑒定和評(píng)價(jià)成為促進(jìn)蛹蟲草培育及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要推力。

1 蛹蟲草指紋圖譜研究

1.1 中藥指紋圖譜

中藥指紋圖譜鑒別、鑒定中藥需有一定基礎(chǔ)和前提條件，例如對(duì)中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識(shí)，一旦沒有足夠前提，中藥指紋圖譜鑒別能力將會(huì)大大降低[9]。中藥指紋光譜分析不需要具體測(cè)試中藥活性組分具體含量，具有很強(qiáng)的整體性、模糊性、全面性[10]。中藥化學(xué)指紋圖譜分析一般采用以下幾種方法。

1.1.1 光譜法

利用被測(cè)中藥不同物質(zhì)對(duì)光的吸收性能的差異性，對(duì)中藥不同活性物質(zhì)和有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定和分析。中藥化學(xué)鑒定通常采用紅外光譜法、紫外光譜法、近紅外光譜法等[11]。光譜法測(cè)得蛹蟲草胞內(nèi)多糖濃度[12]統(tǒng)計(jì)情況如表1所示。

表1 蛹蟲草胞內(nèi)多糖濃度統(tǒng)計(jì)情況Tab.1 Concentration statistics of intracellular polysaccharides of Cordyceps militaris

如表1可知，蛹蟲草胞內(nèi)多糖濃度樣本集為60個(gè)，其中最大值為2.764 g·L-1，最小值為0.685 g·L-1，平均值為 1.677 g·L-1。

1.1.2 色譜法

由于中藥樣品各組分在不同相態(tài)中的選擇性分配不同，對(duì)被測(cè)中藥樣品進(jìn)行不同相態(tài)洗脫，達(dá)到分離不同中藥組分的目的。色譜法又分高效液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、超臨界流體色譜法、高速逆流色譜法等[13]。

1.1.3 質(zhì)譜法

被測(cè)中藥各組分分子在質(zhì)譜分析儀中會(huì)被裂解為碎片。由于分子差異性，這些碎片顯示的圖譜也存在差異性，故能較好鑒定中藥組分。質(zhì)譜法的檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 質(zhì)譜法檢測(cè)蛹蟲草胞內(nèi)重金屬含量標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Mass spectrometric method for detection of heavy metal content in Cordyceps militaris

如表2所示，其中質(zhì)譜法檢測(cè)蛹蟲草胞內(nèi)重金屬含量在砷含量、鉛含量、鉻含量、銅含量、鎘含量幾個(gè)指標(biāo)檢測(cè)數(shù)值中均為存在超標(biāo)情況。

1.1.4 核磁共振法

采用核磁共振法可以提取中藥不同組分中特征性化學(xué)成分的純化單體，具有很高穩(wěn)定性、專一性。

1.1.5 X射線衍射法

利用不同物質(zhì)、結(jié)構(gòu)在X射線下產(chǎn)生的特定衍射圖譜進(jìn)行中藥活性物質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒別。

1.1.6 免疫測(cè)定法

利用免疫學(xué)原理，將被測(cè)樣品作為免疫原抗體進(jìn)行中藥活性物質(zhì)測(cè)定。

因紅外光譜分析儀往往體積小、測(cè)速分析快捷，并且紅外光譜分析儀在抗壓力、抗抖動(dòng)振動(dòng)以及溫度變化等方面性質(zhì)優(yōu)越。在近年來，紅外光譜分析還實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥原材料、成藥、注射劑以及連續(xù)加工的中藥材進(jìn)行測(cè)定和監(jiān)控，故紅外光譜分析在中藥加工和質(zhì)量控制鑒別領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛。

1.2 蛹蟲草指紋圖譜樣品常規(guī)制備

參照2005版《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定，取4 mg蛹蟲草樣品與200 mg溴化鉀粉末于瑪瑙乳缽中并置于紅外燈下研磨、混合均勻，置入壓片模具中1 min左右，制成備試樣品，放置于傅里葉變換紅外分析儀中進(jìn)行測(cè)試分析[14]。此外，為保證測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確性、科學(xué)性，還需要對(duì)傅里葉變換紅外分析儀以及樣品制備方法進(jìn)行穩(wěn)定性、重復(fù)性測(cè)試。

2 蛹蟲草紅外指紋圖譜分析進(jìn)展

2.1 同類官能團(tuán)指紋圖譜分析

中藥質(zhì)量紅外光譜評(píng)價(jià)體系重要建設(shè)者、清華大學(xué)教授孫素琴指出，采用紅外光譜對(duì)中藥多組分進(jìn)行鑒定分析時(shí)要特別注意，多組分中藥不同成分整體形成疊加峰，是由于這些不同成分具有同類官能團(tuán)；這就需要在此基礎(chǔ)上對(duì)目標(biāo)物質(zhì)組群進(jìn)行逐級(jí)使用二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜等分析能力更高的方法進(jìn)行進(jìn)一步分析；并且借助如相似度量化評(píng)價(jià)等多種識(shí)別手段對(duì)多產(chǎn)地、多組分中藥進(jìn)行質(zhì)量控制分析和鑒別，盡可能真實(shí)、全面、宏觀地反映所測(cè)中藥樣品整體信息[3]。蛹蟲草紅外指紋圖譜分析結(jié)果如圖1所示。

如圖1可知，蛹蟲草紅外指紋圖譜分析結(jié)果在營(yíng)養(yǎng)成分上表現(xiàn)出多維空間，其中含有冬蟲夏草含有蟲草酸7%、蛋白質(zhì)25%、脂肪8%，其中82%為人體不能合成而又必需的不飽和脂肪酸，碳水化合物29%，游離氨基酸12種，水解液氨基酸18種，蟲草菌素、半乳甘露聚糖、麥角脂醇、六碳糖醇、生物堿、尿嘧啶、腺嘌呤、維生素B1、維生素B2、多糖及礦物質(zhì)等[15]。

檢測(cè)和分析過程的簡(jiǎn)潔化、高效化、合理化、便捷化是推動(dòng)中藥紅外指紋圖譜分析體系廣泛應(yīng)用的重要因素，在具體實(shí)踐中不斷檢驗(yàn)、調(diào)整和完善該體系理論知識(shí)，提升多組分中藥鑒別和質(zhì)量控制水平。

2.2 蟲草與偽蟲草紅外指紋圖譜相似度分析

詹澤蘋、李華等[1]對(duì)冬蟲夏草繁育品種紅外指紋圖譜相關(guān)研究為我國(guó)多組分中藥鑒別和質(zhì)量控制探索出新的發(fā)展道路和思考方向。該研究將蟲草（繁育品和野生品）和偽蟲草（蟬花、蟲草花等）進(jìn)行紅外測(cè)試，得到對(duì)應(yīng)的紅外光譜原圖，再將蟲草（野生品）紅外光譜原圖進(jìn)行平均化處理得到平均圖譜，作為蟲草（繁育品）和偽蟲草紅外光譜標(biāo)準(zhǔn)參照?qǐng)D譜，而蟲草和偽蟲草的一階導(dǎo)數(shù)圖譜和二階導(dǎo)數(shù)圖譜則使用Norris導(dǎo)數(shù)過濾器對(duì)紅外光譜原圖處理而得[1]。表3為該實(shí)驗(yàn)部分蟲草與偽蟲草紅外指紋圖譜原圖相似度對(duì)比圖。

表3 蟲草與偽蟲草紅外指紋圖譜相似度結(jié)果Tab.3 Similarity results of infrared fingerprints of Cordyceps and pseudo Cordyceps

通過對(duì)比可以明顯發(fā)現(xiàn)，蟲草和偽蟲草紅外光譜圖總體分布特征和相似度，蟲草和偽蟲草的紅外光譜原圖雖然具有較高相似度。但是蟲草與偽蟲草的一階導(dǎo)數(shù)圖譜和二階導(dǎo)數(shù)圖譜疊加對(duì)比圖仍具有顯著差異，充分顯示紅外指紋圖譜法可以用于蟲草等多組分中藥鑒別的質(zhì)量控制。

2.3 蛹蟲草指紋圖譜分析

王瑞華[2]在蛹蟲草指紋圖譜分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的研究在一定程度上建全了蛹蟲草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)，其中包含人工蛹蟲草性狀、檢測(cè)和質(zhì)量控制等，是蛹蟲草質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系中較為全面、系統(tǒng)的鑒別方法。除了參照國(guó)家中藥色譜指紋圖譜相似度相關(guān)評(píng)價(jià)體系對(duì)蛹蟲草中的重要核苷類化合物蟲草素等活性物質(zhì)的鑒定之外，還重復(fù)考查和檢測(cè)指紋圖譜的穩(wěn)定性和精密度，并就人工蛹蟲草指紋圖譜分析方法做出一定補(bǔ)充。其結(jié)果表明，該方法不僅能充分體現(xiàn)不同批次人工蛹蟲草的產(chǎn)地一致性，還突出了蛹蟲草藥材本身的整體化學(xué)特征，對(duì)于蛹蟲草質(zhì)量控制和鑒定具有重要借鑒意義[16]。該研究也為蛹蟲草質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)理論建設(shè)提出一系列可行性建議。例如深入開展中藥指紋圖譜與中藥藥理作用相關(guān)性研究、中藥重要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)活性組分化學(xué)性質(zhì)與指紋圖譜相關(guān)性研究、中藥藥物活性化合物結(jié)構(gòu)與指紋圖譜相關(guān)性研究，以及建立全面化、綜合化、科學(xué)化指紋圖譜庫(kù)等，為未來中藥指紋圖譜發(fā)展指明新的方向[17]。

3 結(jié)論與展望

從蛹蟲草與偽蟲草的相似度研究及同產(chǎn)地不同批次蛹蟲草質(zhì)量控制研究，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛹蟲草紅外指紋圖譜與其主要活性物質(zhì)化學(xué)成分信息較為全面的分析。但是由于我國(guó)該領(lǐng)域研究仍相對(duì)較少，研究人員缺乏相關(guān)參照品和參照數(shù)據(jù)，蛹蟲草質(zhì)量控制評(píng)價(jià)體系仍需進(jìn)一步完善。

蛹蟲草作為珍貴中藥材，在經(jīng)濟(jì)和科技雙重加持之下，實(shí)現(xiàn)廣泛培育和養(yǎng)殖已然不是空談。在蛹蟲草有效活性組分鑒定和質(zhì)量控制方面，指紋圖譜分析技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥鑒別方法的不足和一定缺陷，打破學(xué)科壁壘，促進(jìn)多學(xué)科、多領(lǐng)域之間的有效互動(dòng)和交流。