程歡歡 任靜 宋莉莎 李忠

摘要：月季灰霉病是貴陽市烏當(dāng)區(qū)月季種植區(qū)發(fā)生最嚴(yán)重的真菌病害之一。本研究采用組織分離法和致病性測(cè)定，分離到1株引起該病的病原菌，通過形態(tài)學(xué)特征觀察及RPB2、HSP60、G3PDH多基因序列分析，表明引起該病害的病原菌為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。生物學(xué)特性研究表明：該病原菌生長較好的培養(yǎng)基為PDA;菌絲生長最適碳、氮源分別為葡萄糖、硝酸銨;最適生長溫度為20 ℃;最適pH為6;光照對(duì)病原菌菌絲生長差異顯著，其中12 h光暗交替條件下病原菌生長較好。病原菌菌絲致死溫度為42 ℃ 10? min。

關(guān)鍵詞：月季;灰霉病;灰葡萄孢;鑒定;生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S68512

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2020）02-0087-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.02.015

Pathogen identification and biological characteristic of grey mold on Rosa chinensis in Guiyang

CHENG Huanhuan1，REN Jing2，SONG Lisha1，LI Zhong1，3*

（1Agricultural College，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2 Agricultural Bureau of Wudang District，Guiyang City，Guizhou Province，Guiyang，Guizhou? 550018，China; 3 Guizhou Key Laboratory of Propagation and Cultivation on Medicinal Plants，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Grey mold of China rose is the most serious fungal disease of Chinese rose in Wudang District，Guiyang City Tissue isolation and pathogenicity determination were used to isolated a pathogenic strain that caused grey mold Morphological characteristics observation and multi-locus phylogenetic analyses o fRPB2 HSP60 and G3PDH polygenic sequence analysis showed that the pathogen was Botrytis cinereaThe results of biological characteristics of B cinerea showed that PDA was the optimal medium for the growth of the pathogen; the optimal sources of carbon and nitrogen for the growth of hyphae were glucose and ammonium nitrate; the optimum growth temperature was 20 ℃; the optimal pH was 6; the growth of mycelia of pathogenic bacteria was significantly different by light The pathogen grew better under the condition of 12 h alternating light and darkThe lethal temperature for the mycelial of Bcinerea was 42 ℃ for 10 min

Keywords：Rosa chinensis Jacq; grey mold; Botrytis cinerea; identification; biological characteristic

月季（Rosa chinensis Jacq），又名“月月紅”，為常綠、半常綠低矮灌木，是我國傳統(tǒng)名花之一[1]，四季均可開花?；ㄉ话銥榧t色和粉色，偶有白色和黃色，既是觀賞類植物，也作為藥用類植物[2]。因其花色多樣，花期較長，株型多變，有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，在綠化、美化環(huán)境、家居裝飾等多個(gè)領(lǐng)域都有較好的應(yīng)用前景和較高的觀賞價(jià)值，是享譽(yù)國內(nèi)外的重要花卉，素有“花中皇后”之稱[35]。近年來，貴陽市廣泛種植月季，但在種植過程中因氣候條件和栽培方式存在差異，導(dǎo)致月季白粉病、灰霉病、霜霉病等主要病害的大量發(fā)生而降低花的質(zhì)量[67]。

灰霉病是月季最常見的病害之一[8]，可導(dǎo)致月季葉片產(chǎn)生褐色斑點(diǎn)，最終葉片褐變枯死，嚴(yán)重的會(huì)致使一些枝條甚至整個(gè)植株枯死，灰霉病菌的感染嚴(yán)重降低了月季的觀賞性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究在貴陽市烏當(dāng)區(qū)月季種植區(qū)采集具有典型月季灰霉病病害的標(biāo)本，并對(duì)其發(fā)病花瓣進(jìn)行病原菌的分離純化、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定及生物學(xué)特性測(cè)定，為今后研究該病害的流行規(guī)律和防治方法提供依據(jù)。

1材料與方法

11病害調(diào)查及癥狀觀察

2018年10月在貴州省烏當(dāng)區(qū)花園小鎮(zhèn)，采集具有月季灰霉病典型癥狀的植株，觀察并記錄病害特征。

12病原菌的分離與鑒定

121病原菌分離

采用常規(guī)組織分離法[9]，先用清水將病變花瓣洗凈，切取發(fā)病典型的月季病健交界處5 mm×5 mm 的小塊，先用75%的酒精浸潤30 s，然后用無菌水沖洗3～4次，無菌操作后將病組織置于PDA上，轉(zhuǎn)至25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3 d后進(jìn)行病原菌的純化后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

122致病性測(cè)定

選取健康的月季植株，對(duì)花瓣進(jìn)行消毒處理，打取直徑5 mm菌餅于花瓣上，同時(shí)以不接菌餅的健康植株作為對(duì)照;每處理3次重復(fù)，保濕、觀察并記錄月季花瓣發(fā)病情況[10]。

123形態(tài)學(xué)鑒定

將分離的菌株編號(hào)為RJ437，并接種于PDA平板上25 ℃恒溫光照培養(yǎng)，觀察記錄其菌落特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)[6];根據(jù)菌株RJ437的形態(tài)特征初步確定其分類地位。

124分子生物學(xué)鑒定

選擇真菌DNA提取試劑盒（Biomiga Fungal gDNA Kit）提取供試菌株DNA，對(duì)灰霉病病原菌的RPB2、HSP60、G3PDH

基因序列進(jìn)行擴(kuò)增（表1）。PCR產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在 NCBI 中進(jìn)行同源性比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其RPB2、HSP60、G3PDH序列已上傳至GenBank，其對(duì)應(yīng)登陸號(hào)分別為MN566559、MN566560、MN566561。采用 MEGA 6系統(tǒng)發(fā)育軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)后，采用最大簡約法[11]進(jìn)行分析運(yùn)算，參照馬維思等人[12]的研究報(bào)道選取21個(gè)葡萄孢屬菌株（表2），構(gòu)建基于RPB2、HSP60、G3PDH序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

13病原菌生物學(xué)特性研究

131不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長的影響

參照袁月等人[13]的研究方法，將直徑為5 mm的病原菌菌餅分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（GPA）、察氏培養(yǎng)基（Czapek）、淀粉瓊脂培養(yǎng)基（SA）、清水瓊脂培養(yǎng)基（WA）平板中央（d=9 cm），每處理3次重復(fù)，20 ℃恒溫光照培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

132病原菌對(duì)碳、氮源的利用

利用Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[13]，取病原菌菌餅分別接種至以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉配制成不同碳源的固體培養(yǎng)基中央及以硝酸銨、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鈉配制成不同氮源的固體培養(yǎng)基中央，分別置于

20 ℃恒溫光照培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落生長直徑。

133不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響

取病原菌菌餅至滅菌處理后的PDA培養(yǎng)基平板上，分別置于5、10、15、20、25、30和35共7個(gè)溫度處理下光照培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落生長直徑。

134不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響

用1 mol/L 的HCL和1 mol/LNaOH緩沖液將滅菌處理后的PDA培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值分別為40、50、60、70、80、90和100共7個(gè)梯度，將5 mm的菌餅置于已調(diào)節(jié)好pH值的PDA平板中央。分別置于20℃恒溫光照培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落生長直徑。

135光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響

將病原菌菌餅移至PDA平板中央，在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置24 h連續(xù)黑暗、24 h連續(xù)光照（40 W日光燈）、12 h光暗交替處理共3種光照條件，分別置于20 ℃恒溫培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落生長直徑。

136病原菌菌絲致死溫度測(cè)定

將病原菌菌餅接入規(guī)格為15 mm×20 mm滅菌試管中，每管10 mL無菌蒸餾水，每管接入3～5塊菌餅，分別將試管置于

30、35、40、45、50、55、60和65 ℃共8個(gè)溫度處理的恒溫水浴鍋中水浴10 min，期間緩慢搖動(dòng)試管使之受熱均勻，將處理后的病原菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板中央，每處理重復(fù)3次，20 ℃恒溫光照培養(yǎng)5 d，觀察菌絲生長情況。視菌絲生長結(jié)果采用相同方法，將菌餅分別置于更小溫度間隔下進(jìn)行更精確的測(cè)定，每處理3次重復(fù)[14]。

2結(jié)果與分析

21病害癥狀

圖1所示，該病害主要侵染月季的花、葉片和嫩枝，花萼部最容易受侵染。發(fā)病多從花瓣邊緣開始，初呈水漬狀斑痕，花瓣上出現(xiàn)小斑點(diǎn)，邊緣變褐色，后期花瓣變褐色腐爛萎蔫，在高濕條件下很快發(fā)展成灰褐色、稍凹陷的不規(guī)則病斑，在發(fā)病部位表面密生灰色霉層，使病部發(fā)生褐色腐爛，枝、莖桿疏水功能喪失、易折斷。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)整株死亡。

22致病性測(cè)定

圖2所示，對(duì)月季花瓣部進(jìn)行致病性測(cè)定，接種病原菌的花瓣20 ℃保濕培養(yǎng)48 h后開始表現(xiàn)病狀（圖2B），5天后花瓣全部變黃褐色枯萎腐爛（圖2C），接種發(fā)病的花瓣上再次分離得到的菌株與原接種菌株相同，證實(shí)了該菌株為致病菌。

23病原菌形態(tài)特征

圖3所示，在PDA培養(yǎng)基上20 ℃光照培養(yǎng)5 d，病原菌菌落直徑可達(dá)75～80 cm。菌落初為白色，后期漸變?yōu)闇\褐色（圖3-A、B）。氣生菌絲呈放射狀，可產(chǎn)生黑色菌核，圓形到長圓形，常交織形成不規(guī)則形狀，表面覆有菌絲，直徑 20～4 2 mm;分生孢子梗較細(xì)長、簇生，略帶灰色至褐色，頂端分枝，末端膨大近球形，上有小梗，著生大量分生孢子，呈葡萄穗狀（圖3-C、D）; 分生孢子單胞，橢圓或卵圓形，無色，末端稍突，大小為 63～107 μm× 6 0～92 μm（圖3-E、）;結(jié)合病害癥狀、病原形態(tài)，將其初步鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

24病原菌的分子生物學(xué)鑒定

基于供試菌株的RPB

2、HSP60、G

3PDH基因序列構(gòu)建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。菌株RJ437與Botrytis cinerea SAS405聚集成一支，且支持率達(dá)100%。能與其它種明顯區(qū)分開。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征，將病原菌RJ437鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

25病原菌生物學(xué)特性研究

251培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長的影響

表3所示，病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長直徑最大，其菌落直徑為7441 mm;其次為PSA、GPA、SA、Czapek培養(yǎng)基，菌落直徑依次為7023 mm、6860 mm、6417 mm、5755 mm;WA培養(yǎng)基最不利于病原菌生長。且菌落直徑最小為2386 mm。表明PDA培養(yǎng)基為該菌生長的最適培養(yǎng)基。

252病原菌對(duì)碳、氮源的利用

如表4所示，病原菌能利用多種碳源和氮源。在供試碳源中，病原菌20 ℃恒溫光照培養(yǎng)5 d均能生長，對(duì)葡萄糖利用最好，菌落直徑為7356 mm;其次為果糖，菌落直徑為6847 mm;蔗糖和麥芽糖對(duì)菌絲生長的影響無明顯差異（4968 mm、4633 mm）;病原菌對(duì)可溶性淀粉的利用最差，菌落直徑為3583 mm。在氮源的利用試驗(yàn)中，病原菌對(duì)硝酸銨的利用最好，菌落直徑為7500 mm;其次為硫酸銨和硝酸鈉，菌落直徑分別為6653 mm和6285 mm;對(duì)蛋白胨的利用效果次于硫酸銨，菌落直徑為4363 mm;對(duì)尿素的利用效果最差，菌落直徑為1916 mm。

253不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長的影響

表5所示，在10～30 ℃灰葡萄孢菌絲均可生長，最適溫度為20 ℃，菌落直徑為7340 mm。其次為25 ℃和15 ℃時(shí)，菌落直徑分別為6516 mm、5950 mm;不同溫度條件下菌落擴(kuò)展的速度不同，培養(yǎng)溫度較低（10 ℃以下）時(shí)

，生長慢甚至不生長;培養(yǎng)溫度較高（30 ℃）時(shí)，生長菌絲長勢(shì)弱，生長速度慢，生長直徑為953 mm?；移咸焰呔涑跗跒榘咨?，在溫度不適宜時(shí)，培養(yǎng)基基部會(huì)出現(xiàn)黑色小菌核，菌落生長緩慢且菌落很快變?yōu)榛液稚?/p>

254不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長的影響

如表6所示，菌株在pH 4～10范圍內(nèi)均可生長，不同pH值下的菌落生長情況明顯不同。5 d時(shí)pH值為6的處理菌落生長勢(shì)較為明顯，其菌落直徑為7225 mm，其次為pH值5和7，其菌落直徑分別為6613 mm、5933 mm，pH值4、8、9、10次之，其菌落直徑分別為4673 mm、4152 mm、2776 mm、850 mm，說明灰霉病菌對(duì)在不同pH值條件下的適應(yīng)性較強(qiáng)。

255不同光照對(duì)病原菌菌絲生長的影響

表7所示，病原菌在24 h持續(xù)光照、24 h持續(xù)黑暗、12 h光暗交替處理?xiàng)l件下，菌落平均直徑分別為7213、6742、

7657 mm。其中光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）處理的菌落直徑最大，這說明光暗交替處理為病原菌最適光照條件。

256病原菌菌絲致死溫度

病原菌在水溫30～40 ℃經(jīng)10 min處理的菌餅在PDA培養(yǎng)基上均能繼續(xù)生長，但在45～65 ℃ 10 min處理的菌絲不再生長。然后將菌塊分別置于40～45 ℃的恒溫水浴處理10 min （溫度梯度為1 ℃） ，表明該菌菌絲的致死溫度是42 ℃、10 min。

3結(jié)論與討論

本研究從月季花瓣中分離獲得菌株RJ437，通過對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定和形態(tài)學(xué)特征及RPB2、HSP60、G3PDH聯(lián)合基因序列分析，將引起貴陽市烏當(dāng)區(qū)月季灰霉病的病原菌鑒定為灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。灰葡萄孢（B cinerea）是一種較為常見的病原菌，可引起多種觀賞植物的灰霉病病害，如張蕾等[15]報(bào)道的灰葡萄孢可引起仙客來的灰霉病;杜艷麗等[16]報(bào)道的灰葡萄孢可引起百合的灰霉病，與本研究引起月季灰霉病的病原菌結(jié)果一致。目前，國內(nèi)關(guān)于月季的研究報(bào)道在栽培技術(shù)、觀賞性狀及病害的調(diào)查防治等方面較多[1719]，而針對(duì)貴陽市引起月季灰霉病病原菌的鑒定及生物學(xué)特性的研究未見報(bào)道。

生物學(xué)特性研究結(jié)果表明：月季灰霉病的病原菌灰葡萄孢（Bcinerea）生長最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基;最適碳氮源分別為葡萄糖和硝酸銨;菌絲生長最適溫度為20 ℃，最適pH值為6;不同光照處理對(duì)病原菌菌絲生長的影響差異顯著，12 h光暗交替處理為病原菌最適光照條件，菌絲體致死溫度是42 ℃10 min。盧燕回等[20]研究報(bào)道的煙草灰霉病致病菌灰葡萄孢的最適碳源為葡萄糖，最適生長溫度為20 ℃，最適pH為6;戴啟東[21]報(bào)道的藍(lán)莓灰霉病致病菌灰葡萄孢的最適氮源為硝酸銨，最適生長溫度為20 ℃，最適pH為6;與本試驗(yàn)的結(jié)論基本一致。杜艷麗等[16]報(bào)道的百合灰霉病病原菌灰葡萄孢的適培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基，最適氮源為牛肉膏;李聰麗等[22]報(bào)道的香蔥灰霉病病原菌灰葡萄孢最適碳氮源分別為可溶性淀粉、酵母粉，菌絲致死溫度是52 ℃（10 min） ;與本研究結(jié)果不一致，可能與寄主、地區(qū)氣候海拔等因素不同以及選擇的供試碳氮源不同而存在差異。

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