許小茜 李清清 顧穎娟

(上海質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233)

作為近年新興發(fā)展起來的奶粉品類，與牛奶粉相比，羊奶粉成分組成與母乳更為接近，并具有牛奶粉所不具備的優(yōu)勢特征：脂肪結(jié)構(gòu)與母乳相似，碳鏈短，且含有較低的α-酪蛋白，人體易消化吸收；含有8種人體必需的氨基酸；含有更多Ca、P、Mg、Cu等礦物元素；富含DHA、核苷酸及腦磷脂等，可促進(jìn)人體大腦神經(jīng)和視力發(fā)育；特有的上皮細(xì)胞生長因子(EGF)，可促進(jìn)對肌膚粘膜損傷的修復(fù)，超氧化物歧化酶可起到清除自由基、抗衰老等美容作用[1-3]。近年來，在羊奶的營養(yǎng)價(jià)值及生物功能領(lǐng)域開展了大量的臨床研究，羊奶及其制品正逐漸成為嬰幼兒、特別是不能耐受牛奶及患有胃腸道疾病的嬰幼兒，甚至作為老年人和營養(yǎng)不良患者的良好乳源。

氯酸鹽和高氯酸鹽是一種持續(xù)性的環(huán)境污染物。高氯酸鹽可以競爭性結(jié)合鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)從而干擾人體正常代謝；氯酸鹽是飲用水消毒產(chǎn)生的副產(chǎn)物，影響人體的血液系統(tǒng)和甲狀腺系統(tǒng)，從而影響人體健康。在食品的生產(chǎn)、包裝過程中，為抑制微生物的生長繁殖，工廠生產(chǎn)線的清潔消毒過程中極易引入高氯酸鹽和氯酸鹽，且難以清除干凈[4-6]。因此研究開展羊奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的定量分析具有重要意義。

目前，測定氯酸鹽和高氯酸鹽的方法主要有離子色譜電導(dǎo)法[7-9]、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]等。其中離子色譜電導(dǎo)法是檢測飲用水中高氯酸鹽的主流方法， 但該方法易受基質(zhì)中較高濃度的氯離子和硫酸根離子干擾，難以準(zhǔn)確地對樣品中的高氯酸鹽進(jìn)行定性、定量分析。另一方面離子色譜法靈敏度較低，對含量較低的樣品無法有效檢測。離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法克服了離子色譜電導(dǎo)法的不足，但其流動(dòng)相多為無機(jī)酸堿，不適合直接進(jìn)入離子源，需經(jīng)過抑制法轉(zhuǎn)換成H2O，檢測成本較高，操作復(fù)雜，且離子色譜儀與質(zhì)譜儀的聯(lián)用設(shè)備較少且價(jià)格昂貴，難以普及。此外，如果是檢測奶粉中的氯酸鹽和高氯酸鹽含量，需要用有機(jī)試劑進(jìn)行沉淀蛋白，過高的有機(jī)試劑對離子色譜的基線有嚴(yán)重影響。高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法具有良好的靈敏度和選擇性，且設(shè)備普及更為廣泛，方法利于推廣應(yīng)用。

本研究擬采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對羊奶粉中的氯酸鹽和高氯酸鹽的含量進(jìn)行測定，同時(shí)結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)對結(jié)果進(jìn)行修正，減少樣品基質(zhì)對目標(biāo)物的干擾，建立高效、靈敏度高、穩(wěn)定性好的檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料

被測羊奶粉總共79個(gè)批次，其中1段奶粉30批次，2段奶粉29批次，3段奶粉20批次。

1.2 儀器與試劑

TQ-XS高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Xevo TQ-XS,美國Waters公司)；超純水發(fā)生器(Milli-Q，美國Milli-Q公司)；旋渦振蕩儀(D-91126 Schwabach，德國Heidolph公司)；高速離心機(jī)(Centrifuge 5804，德國Eppendorf公司)；超聲波清洗器(SK8210LHC，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Waters 0asis PRiMEHLB固相萃取柱(Waters 0asis PRiMEHLB，3cc，150mg，美國waters公司)。

超純水(質(zhì)譜級，F(xiàn)isher)；乙腈(質(zhì)譜級，TEDIA)；甲醇(質(zhì)譜級，F(xiàn)isher)；甲酸銨(質(zhì)譜級，ACS)；甲酸(質(zhì)譜級，ACS)；氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，O2Si)；高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，CIL)；氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)溶液(有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，EURL-SRM)；高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)溶液(有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，CIL)。

1.3 工作曲線的配制

取高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液配制高氯酸鹽和氯酸鹽混標(biāo)濃度分別為1.00ng/mL、2.50ng/mL、5.00ng/mL、25.0ng/mL、50.0ng/mL， 2.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液中氯酸鹽-18O3、高氯酸鹽-18O4濃度分別為15.0ng/mL、2.0ng/mL。臨用新制。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣2g(精確到0.001g)，置于50mL具塞離心管中，加入100μL混合同位素內(nèi)標(biāo)液，再加入5mL0.1%(v/v)甲酸水溶液，迅速混勻，置于45℃水浴超聲20min，渦旋振蕩5min，再準(zhǔn)確加入10mL乙腈，混勻，于10000r/min下常溫離心10min，取上清液待凈化。

取3mL上清液過PRiME HLB固相萃取柱，并接上0.22umMCE混合纖維素酯膜，收集濾液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：Thermo Acclaim TRINITY P1(50mm×2.1 mm,3μm)；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：3μL；流速：0.4 mL/min；A相為20mmol/L甲酸銨溶液，B相為乙腈(質(zhì)譜級) 梯度淋洗條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.6 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離ESI(-)；毛細(xì)管電壓：2.0kV；脫溶劑溫度：400℃；脫溶劑氣流量800L/h；錐孔氣流量：150L/h；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式采集數(shù)據(jù)。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 氯酸鹽和高氯酸鹽的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

奶粉樣品基質(zhì)復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)，所以在本方法中比較了甲醇和乙腈對蛋白質(zhì)的沉淀效果。發(fā)現(xiàn)使用甲醇作為沉淀蛋白的有機(jī)溶劑時(shí)，凈化后的樣品溶液放置過夜后，瓶底有晶體析出，進(jìn)樣前需要進(jìn)行二次凈化，對儀器中進(jìn)行大批量樣品過夜進(jìn)樣的情況有堵塞進(jìn)樣針的風(fēng)險(xiǎn)。改用乙腈作為沉淀蛋白的有機(jī)溶劑，樣品溶液放置幾天仍可保持澄清，未出現(xiàn)沉淀物。因此在前處理過程中采用5mL0.1%甲酸水溶液超聲提取20min后，加10mL乙腈沉淀蛋白質(zhì)。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1流動(dòng)相甲酸銨濃度的選擇。

甲酸銨的濃度在10～30mmol/L時(shí)，氯酸鹽和高氯酸鹽的峰形良好，差別不明顯。隨著甲酸銨濃度增大，保留時(shí)間往前漂移?？紤]到流動(dòng)相中鹽濃度對質(zhì)譜儀器的影響及選擇合適的保留時(shí)間，最終選取濃度為20mmol/L的甲酸銨溶液為流動(dòng)相。同時(shí)將3.5min后的流動(dòng)相通過六通閥切換至廢液(圖1～圖3)。

2.2.2流動(dòng)性乙腈級別的選擇。

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加，基線會慢慢變高，導(dǎo)致樣品相應(yīng)信號部分被覆蓋。流動(dòng)相里的雜質(zhì)會嚴(yán)重污染整個(gè)流路及離子通道乃至四級桿。因此采用質(zhì)譜級乙腈替代色譜級乙腈作為流動(dòng)相，可以明顯降低基線，且延長色譜柱的壽命(圖4、圖5)。

圖1 濃度為10mmol/L甲酸銨溶液，氯酸鹽和高氯酸鹽的保留時(shí)間

圖2 濃度為20mmol/L甲酸銨溶液，氯酸鹽和高氯酸鹽的保留時(shí)間

圖3 濃度為30mmol/L甲酸銨溶液，氯酸鹽和高氯酸鹽的保留時(shí)間

圖4 采用色譜級乙腈作為流動(dòng)相

2.3 線性范圍、線性方程與檢出限

氯酸鹽線性方程為Y=0.0307302X+0.00184822，相關(guān)系數(shù)為0.9998，在2.0～100.0μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；高氯酸鹽線性方程為Y=0.100267X+0.105331，相關(guān)系數(shù)為0.9998，，在1.0～50.0μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以S/N=3確定本方法中氯酸鹽的檢出限為4.5μg/kg，高氯酸鹽的檢出限為3.0μg/kg，以S/N=10確定氯酸鹽的定量限為15.0μg/kg高氯酸鹽的定量限為7.5μg/kg，可滿足羊奶粉中對氯酸鹽和高氯酸鹽的檢測要求。

2.4 方法的回收與精密度

取空白奶粉樣品，加入15.0、30.0、150μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.4.1)，按實(shí)驗(yàn)方法測定氯酸根和高氯酸鹽含量，重復(fù)測定7次，計(jì)算其回收率和精密度。結(jié)果見表3，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表3 羊奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)

續(xù)表3

2.5 實(shí)際樣品的測定

采用本方法檢測了79種嬰幼兒羊奶粉中的氯酸鹽和高氯酸鹽。結(jié)果表明，大多數(shù)樣品中均檢出氯酸鹽和高氯酸鹽。其中1段羊奶粉氯酸鹽含量范圍在19.5～290μg/kg之間，高氯酸鹽含量范圍在9.50～185μg/kg之間；2段羊奶粉氯酸鹽含量范圍在19.1～617μg/kg之間，高氯酸鹽含量范圍在9.89～409μg/kg之間；3段羊奶粉氯酸鹽含量范圍在31.9～469μg/kg之間，高氯酸鹽含量范圍在36.6～286μg/kg之間。

3 結(jié)論

本研究成功建立并優(yōu)化了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測羊奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽含量的方法，方法優(yōu)化了樣品的提取方法，液相色譜條件。靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，其中氯酸鹽檢出限為4.5μg/kg，定量限為15.0μg/kg，方法的準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率為95.7%～107.2%)，精密度(RSD為1.43%～3.66%)；高氯酸鹽檢出限為3.0μg/kg，定量限為7.5μg/kg，方法的準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率為96.1%～108.6%)，精密度(RSD為2.46%～4.04%)。均能很好地滿足羊奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的分析要求，在實(shí)際工作中具有較強(qiáng)的實(shí)用性，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。