張 也 亓學(xué)奎 張習(xí)志 曲晶明 賈 凱 張婷婷 王欣欣 李 燦*

(1.中國人民解放軍92609部隊，北京 100077；2. 北京市理化分析測試中心，北京 100094；3. 青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司，青島 266101)

隨著現(xiàn)代分析儀器的快速發(fā)展，液相色譜儀已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、醫(yī)藥、生化、天然產(chǎn)物等科學(xué)領(lǐng)域。常見的液相色譜儀主要由高壓或低壓梯度泵、自動進(jìn)樣器、色譜柱和檢測器組成。自動進(jìn)樣器作為色譜儀的重要組成部分，其可靠性和準(zhǔn)確性直接影響液相色譜儀分析的結(jié)果[1，2]。因此，對自動進(jìn)樣器的性能進(jìn)行驗證，能有效地保障液相色譜儀的整體性能指標(biāo)。目前我國評價液相色譜儀性能的《液相色譜儀國家計量檢定規(guī)程》(JJG 705-2014)[3]和《液相色譜儀》(GB/T 26792-2019)[4]法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)均沒有提供自動進(jìn)樣器性能驗證的方法，只有整機的系統(tǒng)性能驗證。相比之下，歐洲委員會官方藥品控制實驗室(OMCL)質(zhì)量控制文件[5]對液相色譜儀的進(jìn)樣器系統(tǒng)作了較為詳盡的要求。OMCL質(zhì)量控制文件屬于一種普遍性的指導(dǎo)文件，實際情況還要根據(jù)自動進(jìn)樣器的特性具體分析。本研究以O(shè)MCL質(zhì)量控制文件提供的進(jìn)樣器系統(tǒng)驗證項目和指標(biāo)和我國JJG 705-2014液相色譜儀檢定規(guī)程規(guī)定的整機性能指標(biāo)為基礎(chǔ)，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研和分析工作經(jīng)驗，確立了自動進(jìn)樣器的性能驗證項目和指標(biāo)，包括進(jìn)樣體積準(zhǔn)確性、進(jìn)樣重復(fù)性(定性和定量)、進(jìn)樣線性及進(jìn)樣殘留。大量研究表明，不同測試物質(zhì)的種類、數(shù)量、濃度等得到的測試結(jié)果會有所差異[6-8]。因此在實際應(yīng)用時，應(yīng)根據(jù)實際測試項目對自動進(jìn)樣器進(jìn)行性能驗證。

醛酮類化合物已經(jīng)成為當(dāng)今大氣環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。該類物質(zhì)既是光化學(xué)煙霧的主要成分，也是光化學(xué)氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，同時也是二次有機氣溶膠生成的重要前體物，通常以相對較高濃度水平存在于我們生活的環(huán)境中[9-12]。此外，醛酮類化合物會對人體健康產(chǎn)生直接的負(fù)面影響，長時間接觸會導(dǎo)致癌癥風(fēng)險的增加[13，14]。因此，針對醛酮類化合物的測試具有重要意義。基于此，本研究在設(shè)計驗證方案過程中，以實用性、適用性和可操作性為基礎(chǔ)，結(jié)合本研究驗證目標(biāo)和實際測試工作內(nèi)容，選用15種醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行自動進(jìn)樣器的性能驗證工作。并參考HJ683-2014《環(huán)境空氣醛、酮類化合物的測定高效液相色譜法》對實際環(huán)境樣品進(jìn)行了測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：iChrom5100，大連依利特分析儀器有限公司；

液相色譜自動進(jìn)樣器：SHA-11D，自主研發(fā)的色譜質(zhì)譜多功能高精度自動進(jìn)樣器(青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司；中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所；北京市理化分析測試中心)。

乙腈：色譜純，德國Merck公司；甲醇：XX；實驗用水：去離子水(電阻率≥18 MΩ·cm)；醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液：美國Supelco公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：360 nm；流動相：乙腈：水=6∶4(V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外可見光檢測器；進(jìn)樣體積：25 μL。

1.3 實驗方法

1.3.1進(jìn)樣體積準(zhǔn)確性

取2 mL的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣小瓶，加入一定量的去離子水，用分析天平稱重，記錄樣品瓶的質(zhì)量W1(g)，將樣品瓶置于自動進(jìn)樣器樣品盤內(nèi)，啟動進(jìn)樣器開始測量。取樣量分別設(shè)置為25 μL和100 μL，各連續(xù)取樣10次，取樣結(jié)束后再次對樣品瓶進(jìn)行秤重，記為W2(g)，重復(fù)此步驟3次，得到前后差值的平均值。自動進(jìn)樣器的體積誤差按公式(1)計算：

(1)

式中，V0為取樣量設(shè)定值，μL；ρ為試驗溫度下水的密度，g/mL。

1.3.2進(jìn)樣重復(fù)性

配制濃度為0.2 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1的醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液各連續(xù)進(jìn)樣10次，考察不同濃度下的重復(fù)性，對分析譜圖進(jìn)行積分，分別得到相應(yīng)的峰面積，同時記錄下色譜峰的保留時間。根據(jù)式(2)計算峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%，得到定量和定性重復(fù)性。

(2)

1.3.3進(jìn)樣線性

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶劑甲醇稀釋，制得標(biāo)準(zhǔn)儲備液。采用逐級稀釋法配制成濃度為0.2μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。按照設(shè)定的色譜條件進(jìn)行測定，以色譜峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算線性相關(guān)系數(shù)。

1.3.4進(jìn)樣殘留

配制濃度為5 μg/mL醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積A2，取算術(shù)平均值，再進(jìn)空白溶劑(純甲醇)1針，記錄空白溶劑的峰面積A1，根據(jù)式(3)計算樣品殘留率(R)。

(3)

2 驗證結(jié)果與討論

2.1 進(jìn)樣體積準(zhǔn)確性

按照1.2設(shè)定的色譜條件和1.3.1的驗證方法得到進(jìn)樣體積25 μL和100 μL下準(zhǔn)確性驗證的數(shù)據(jù)。具體結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，兩種不同進(jìn)樣體積下相對誤差均小于0.5%。

表1 不同進(jìn)樣體積下準(zhǔn)確性驗證數(shù)據(jù)表

2.2 進(jìn)樣重復(fù)性

為考察不同濃度下的定量和定性重復(fù)性，按照1.3.2的驗證方法計算了15種醛酮化合物的峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%，分析結(jié)果見表2和表3，樣品色譜圖見圖1和圖2。

表2 0.2 μg/mL醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣重復(fù)性數(shù)據(jù)

表3 1.5 μg/mL醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣重復(fù)性數(shù)據(jù)

由表2和表3可以看出，醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.2 μg/mL和1.5 μg/mL兩種濃度下，定量重復(fù)性(n=10)分別為0.17%～1.46%、0.14%～0.65%。15種醛酮化合物定量重復(fù)性均符合JJG705-2014液相色譜儀國家計量檢定規(guī)程規(guī)定的整機性能定量重復(fù)性RSD%≤3.0%的技術(shù)指標(biāo)。除低濃度下后出峰的5種化合物外，其余均符合歐洲醫(yī)藥管理局(OMCL)對液相色譜儀性能檢驗峰面積重復(fù)性RSD%≤1.0%的技術(shù)指標(biāo)。兩種濃度下的定性重復(fù)性(n=10)分別為0.14%～1.76%、0.16%-1.51%。絕大部分符合JJG705-2014液相色譜儀國家計量檢定規(guī)程規(guī)定的定性重復(fù)性RSD%≤1.0%的技術(shù)指標(biāo)。

圖1 0.2 μg/mL醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)10次進(jìn)樣色譜圖1.甲醛；2.乙醛；3,4.丙烯醛、丙酮；5.丙醛；6.丁烯醛；7.丁醛；8.苯甲醛；9.異戊醛；10.戊醛；11.鄰-甲苯甲醛；12,13.間、對甲苯甲醛；14.己醛；15.2,5-二甲苯甲醛

圖2 1.5 μg/mL醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)10次進(jìn)樣色譜圖

從進(jìn)樣重復(fù)性的譜圖中可以看出(圖1和圖2)，隨著進(jìn)樣物質(zhì)濃度的增加，相應(yīng)峰的強度和面積也隨之增加，峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差偏小，但這并不意味著濃度越高，定量重復(fù)性越好。保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在兩種濃度下差別不大?？傮w而言，后出峰的化合物保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差偏大一些，這可能與化合物的分子量、分配系數(shù)、柱效及檢測器性能等都有一定的關(guān)系。

2.3 進(jìn)樣線性

按照1.2設(shè)定的色譜條件和1.3.3的驗證方法，得到5個系列濃度下15種醛酮化合物的線性驗證的數(shù)據(jù)。具體結(jié)果見表4。由表4可以看出，醛酮15種組份在各自的線形范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線形關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.9994，滿足JJG705-2014液相色譜儀國家計量檢定規(guī)程和OMCL規(guī)定的線性相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不小于0.999。

表4 醛酮線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.4 進(jìn)樣殘留

15種醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的進(jìn)樣殘留結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出，在連續(xù)注入5 μg/mL醛酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后，各組份在相應(yīng)的保留時間，可以看到明顯的重疊色譜峰，而隨后注入甲醇空白溶劑后，在色譜圖上觀察不到明顯的色譜峰。從得到的積分?jǐn)?shù)據(jù)中可以看到(表5)，15種醛酮化合物的進(jìn)樣殘留率在0.00%～0.05%之間。各組份的進(jìn)樣殘留均滿足OMCL規(guī)定的進(jìn)樣殘留≤0.2%。

表5 15種醛酮化合物的進(jìn)樣殘留結(jié)果

圖3 15種醛酮化合物的進(jìn)樣殘留色譜圖

2.5 實際樣品測定

利用組建的自動進(jìn)樣器-高效液相色譜儀，參照HJ683-2014《環(huán)境空氣醛、酮類化合物的測定高效液相色譜法》對某密閉空間內(nèi)進(jìn)行了實際環(huán)境樣品測試，測定結(jié)果表明，某密閉空間內(nèi)存在一定的醛酮類污染。實際樣品測定結(jié)果見表6，樣品色譜峰見圖4。

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一套液相色譜自動進(jìn)樣器的性能驗證方案，包括進(jìn)樣體積準(zhǔn)確性、進(jìn)樣重復(fù)性、進(jìn)樣線性及進(jìn)樣殘留驗證。并根據(jù)建立的的驗證方案，選用15種醛酮化合物對自研發(fā)的自動進(jìn)樣器進(jìn)行了性能評價。結(jié)果表明，15種醛酮化合物在0.2 μg/mL和1.5 μg/mL兩種濃度下，定量重復(fù)性(n=10)分別為0.17%～1.46%、0.14%～0.65%。均符合JJG823-2014離子色譜儀國家計量檢定規(guī)程規(guī)定的整機性能定量重復(fù)性RSD≤3.0%的技術(shù)指標(biāo)。除低濃度下后出峰的5種化合物外，其余均符合歐洲醫(yī)藥管理局(OMCL)對液相色譜儀性能檢驗峰面積重復(fù)性RSD≤1.0%的技術(shù)指標(biāo)。兩種濃度下的定性重復(fù)性(n=10)分別為0.14%～1.76%、0.16%～1.51%。絕大部分符合JJG705-2014液相色譜儀國家計量檢定規(guī)程規(guī)定的定性重復(fù)性RSD≤1.0%的技術(shù)指標(biāo)。醛酮15種組份在各自的線形范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線形關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)(R2)均≥0.9994，滿足JJG705-2014液相色譜儀國家計量檢定規(guī)程和OMCL規(guī)定的線性相關(guān)系數(shù)R應(yīng)不小于0.999。15種醛酮化合物的進(jìn)樣殘留率在0.00%～0.05%之間。各組份的進(jìn)樣殘留均滿足OMCL規(guī)定的進(jìn)樣殘留≤0.2%。上述指標(biāo)均滿足實際樣品的測試要求，證實了該驗證體系的可行性、實用性和適用性。但由于液相色譜儀進(jìn)樣器系統(tǒng)的生產(chǎn)廠家、種類繁多，用戶對儀器性能的要求及需求各不相同，儀器使用者在制訂具體的液相色譜儀進(jìn)樣器系統(tǒng)的性能驗證方案時，可參考本方案，對驗證項目、方法及技術(shù)指標(biāo)做合理地調(diào)整和優(yōu)化。

表6 實際樣品測定結(jié)果 μg/m3

圖4 實際樣品中醛酮的色譜圖