姜彩霞 ，姜秀杰 ，李晶 ，鄭喜群

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院）

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的通稱。乳酸菌自身在代謝過程中能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，這些物質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)的核糖體中合成具有抑菌活性的多肽類物質(zhì)，能夠?qū)Χ喾N細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用[1]。同時(shí)，乳酸菌也被認(rèn)為是人體腸道中的重要微生物之一，與人體的健康息息相關(guān)[2-4]。嗜酸乳桿菌是乳酸菌家族中的重要成員[5-6]，具有維持腸道的微生態(tài)平衡，降低腸道內(nèi)的pH值，預(yù)防和抑制病原菌及腫瘤的發(fā)生等功能特性，還可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)消化[7-10]。國內(nèi)外很多知名的乳品公司都將嗜酸乳桿菌菌粉添加到嬰幼兒配方奶粉中，用于調(diào)節(jié)嬰兒胃腸道菌群平衡，同時(shí)對(duì)兒童部分情況引起的腹瀉也具有一定的臨床效果[11-12]。

近年來，隨著人們健康意識(shí)的逐步增強(qiáng)，益生菌類食品在世界功能性食品中所占的份額逐漸增大[13-15]，其中，乳酸菌在國內(nèi)外食品行業(yè)都已得到了廣泛的應(yīng)用，且年產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)[13-15]，但目前市場(chǎng)上同類產(chǎn)品活菌數(shù)量參差不齊，國內(nèi)很多廠家使用的菌種都是國外企業(yè)的專利菌株，試驗(yàn)則從一株嗜酸乳桿菌的普通菌株出發(fā)，為我國益生菌行業(yè)的發(fā)展提供新思路。同時(shí)，大量研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基的組分和配比以及培養(yǎng)條件對(duì)嗜酸乳桿菌的增殖和生長影響十分顯著[16-17]。試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化了嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)條件，力求活菌含量高，培養(yǎng)過程操作簡單、成本低。另一方面，采用真空冷凍干燥方法制備凍干菌粉的過程中，由于低溫環(huán)境對(duì)菌體的活性會(huì)產(chǎn)生一定的影響，因此需要添加一定量的低溫保護(hù)劑減少活菌數(shù)的降低[18-20]。通過將主要的增殖培養(yǎng)條件和低溫保護(hù)劑利用正交試驗(yàn)進(jìn)行綜合優(yōu)化，旨在得到適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝參數(shù)，為我國嗜酸乳桿菌類益生菌食品的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。同時(shí)也為我國益生菌類食品生產(chǎn)廠家以降低生產(chǎn)成本、增強(qiáng)產(chǎn)品的市場(chǎng)競爭力為目的進(jìn)行自主研發(fā)和生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種和試劑

嗜酸乳桿菌凍干菌種（中國微生物菌種查詢網(wǎng)）；試驗(yàn)用試劑和化學(xué)藥品均為常規(guī)國產(chǎn)產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：酪蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母膏0.5%，葡萄糖2.0%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸二胺0.2%，吐溫80 0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，七水硫酸鎂 0.02%，七水硫酸錳 0.005%，pH 6.2～6.4，121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2.0%碳酸鈣和2.0%瓊脂粉，121℃滅菌20 min。

黃豆汁的制備：黃豆200 g，加500 mL水煮沸半小時(shí)后用紗布過濾，加水補(bǔ)至500 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

西紅柿汁的制備：西紅柿200 g，洗凈、切碎，加500 mL水煮沸30 min后用紗布過濾，加水補(bǔ)至500 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器

紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），高速冷凍離心機(jī)（美國beckman），真空冷凍干燥機(jī)（北京思達(dá)興業(yè)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以MRS液體培養(yǎng)基為嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)基，選取不同的搖床轉(zhuǎn)速，分別為0、50、100、150和200 r·min-1；接種量分別為 3%、5%、7%、9%和 11%；黃豆汁作為補(bǔ)充氮源添加量分別為1%、2%、3%、4%和5%；西紅柿汁作為增殖因子其添加量分別為6%、8%、10%、12%和14%。在以上各條件下培養(yǎng)溫度均為37℃，培養(yǎng)時(shí)間均為20～24 h，且均以發(fā)酵液的OD600作為指標(biāo)進(jìn)行分析。

1.3.2 低溫保護(hù)劑對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響

嗜酸乳桿菌發(fā)酵液于4℃下5 000 r·min-1，離心10 min 獲得菌泥，靜止 30 min 后按照 1∶3（v/v）加入無菌水懸浮清洗2次，合并清洗液分別加入NaCl、脫脂乳粉、甘油和谷氨酸鈉配制成不同濃度的保護(hù)劑，其中 NaCl濃度（m/v）分別為 0%、0.2%、0.4%、0.6%和0.7%；脫脂乳粉濃度（m/v）分別為0%、5%、10%、15%和20%；甘油濃度（m/v）分別為0%、1%、2%、3%和4%；谷氨酸鈉濃度（m/v）分別為0%、1%、2%、3%和4%。

1.3.3 增殖培養(yǎng)條件與低溫保護(hù)劑提高冷凍干燥后嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的正交試驗(yàn)

將黃豆汁和西紅柿汁按照3∶10（v/v）的比例混合，在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入發(fā)酵促進(jìn)劑，在真空冷凍干燥前加入低溫保護(hù)劑。因此試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)促進(jìn)劑用量、接種量、脫脂乳粉及甘油4個(gè)因素作為考察因素，以真空冷凍干燥后菌粉的活菌數(shù)（cfu·g-1）為考察指標(biāo)加以優(yōu)化。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 真空凍干菌種的活化培養(yǎng)

嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行安瓿管開封。首次活化干粉要全部用完，干粉用盡量少的MRS培養(yǎng)液溶解，接種到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，放于恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)20～24 h。使用1 mL無菌注射器吸取少量發(fā)酵菌懸液制作涂片，用甲苯胺蘭染色，通過鏡檢確定無雜菌后，再分別以10%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中活化2次，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間均為20～24 h。

1.4.2 活菌數(shù)和發(fā)酵液OD600值的測(cè)定

活菌數(shù)的測(cè)定：采用涂布平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)[6]。

發(fā)酵液OD600值的測(cè)定：在600 nm波長處測(cè)定發(fā)酵液的OD600值，以滅菌后未接種的培養(yǎng)基為空白調(diào)零。

1.4.3 嗜酸乳桿菌生長曲線的測(cè)定

5%接種量，37℃培養(yǎng)，每2 h取樣一次分別測(cè)定發(fā)酵液的OD600值和活菌數(shù)，并繪制嗜酸乳桿菌的生長曲線。

1.4.4 嗜酸乳桿菌凍干菌粉的制備

加入低溫保護(hù)劑的液體盛放在塑料盒中，厚度不超過2 cm，于普通冰箱中放置12 h后轉(zhuǎn)移至低溫冰箱中-30℃預(yù)凍2 h，最后進(jìn)行進(jìn)行真空冷凍干燥，其參數(shù)為-80℃，真空度＜10 pa，冷凍干燥24 h得干燥菌粉。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過對(duì)嗜酸乳桿菌典型生長曲線的測(cè)定確定最佳收獲期

在嗜酸乳桿菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)之前測(cè)定該菌種在MRS液體培養(yǎng)基中的生長曲線是十分必要的，只有準(zhǔn)確地掌握了嗜酸乳桿菌的生長曲線才能確定最佳的接種時(shí)間，進(jìn)而增殖培養(yǎng)。嗜酸乳桿菌的生長曲線分別見圖1。

圖1 嗜酸乳桿菌的生長曲線及培養(yǎng)液活菌數(shù)Fig.1 OD600 value and number of live bacteria in Lactobacillus acidophilus culture medium

從圖1可以看出：隨著培養(yǎng)時(shí)間的不斷延長培養(yǎng)液的OD600值和活菌數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，培養(yǎng)4 h后嗜酸乳桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)培養(yǎng)液的活菌數(shù)也處于較高的水平，為2.01×1010cfu·mL-1，隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長，培養(yǎng)液的OD600值基本保持不變，活菌數(shù)呈現(xiàn)略下降的趨勢(shì)，因此試驗(yàn)嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)的最佳收獲期為20 h，另一方面，培養(yǎng)液的OD600值和活菌數(shù)兩者呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)特性，為簡化試驗(yàn)過程，試驗(yàn)以下各優(yōu)化條件均以培養(yǎng)液的OD600值為指標(biāo)進(jìn)行分析。

2.2 嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 搖床轉(zhuǎn)數(shù)的選擇

一般液體培養(yǎng)均采用搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速便成為了影響菌體生長發(fā)育以及生化代謝的重要工藝參數(shù)之一，因此試驗(yàn)通過比較不同轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)液的OD600值確定最佳的搖床轉(zhuǎn)速，其結(jié)果如圖2。

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)培養(yǎng)液OD值的影響Fig.2 Effect of shaker rotation speed on OD value of culture medium

從圖2中可以看出，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速逐漸增大時(shí)培養(yǎng)液的OD600值呈下降趨勢(shì)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速大于100 r·min-1時(shí)培養(yǎng)液的OD600值下降較明顯，其主要原因可能是嗜酸乳桿菌為耐氧菌，當(dāng)轉(zhuǎn)速較低時(shí)對(duì)其增殖培養(yǎng)影響不大，但當(dāng)轉(zhuǎn)速略大時(shí)增加的溶解氧會(huì)影響其繁殖，因此試驗(yàn)采用靜止培養(yǎng)。

2.2.2 接種量的測(cè)定

培養(yǎng)菌體時(shí)適當(dāng)?shù)慕臃N量是十分必要的，因?yàn)樗軌蛑苯佑绊懢w繁殖的狀態(tài)及周期，不同接種量下培養(yǎng)液的OD600值見圖3。

圖3 接種量對(duì)培養(yǎng)液OD600值的影響Fig.3 Effect of inoculum size on OD600 value of culture medium

從圖3得出：當(dāng)接種量為3%時(shí)培養(yǎng)液中初始菌種含量較低，因此發(fā)酵液的OD600值較低。當(dāng)接種量為5%時(shí)培養(yǎng)液的OD600值最高，隨著接種量的繼續(xù)增大，培養(yǎng)液的OD600值逐漸降低，因此試驗(yàn)確定的最佳的接種量為5%。

2.2.3添加黃豆汁對(duì)嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)的影響

眾所周知，碳源和氮源是培養(yǎng)基的重要組成部分，對(duì)微生物的生長具有十分顯著的影響，大量文獻(xiàn)均表明葡萄糖是嗜酸乳桿菌繁殖和生長的良好碳源，因此試驗(yàn)直接采用葡萄糖作為嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)的碳源[16]。另一方面，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)單一的氮源對(duì)菌體增殖培養(yǎng)的效果往往不如復(fù)合氮源好[16-17]，故試驗(yàn)在MRS液體培養(yǎng)基中添加了少量的黃豆汁作為補(bǔ)充氮源，其對(duì)培養(yǎng)液OD600值的影響見圖4。

圖4 添加黃豆汁對(duì)培養(yǎng)液OD600值的影響Fig.4 Effect of amount of soybean juice on the OD600 value of culture medium

圖4 為添加黃豆汁作為補(bǔ)充氮源對(duì)培養(yǎng)液OD600值的影響。圖4可見，隨著黃豆汁添加量的逐漸增加，培養(yǎng)液的OD600值呈現(xiàn)出先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)黃豆汁的添加量為3%時(shí)培養(yǎng)液的OD600值達(dá)到最大，繼續(xù)增加黃豆汁的添加量培養(yǎng)液的OD600值幾乎不變，故選擇黃豆汁的添加量為3%。

2.2.4 添加西紅柿汁對(duì)嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)的影響

天然提取物富含多種糖類、氨基酸、維生素等多種物質(zhì)，是乳酸菌的常用增殖因子[21]，添加西紅柿汁對(duì)培養(yǎng)液OD600值的影響見圖5。

圖5 添加西紅柿汁對(duì)培養(yǎng)液OD600值的影響Fig.5 Effect of amount of tomato juice on OD600 value of culture medium

圖5 可見，隨著添加量的增加，培養(yǎng)液的OD600值呈現(xiàn)出先增加后略降低的趨勢(shì)，當(dāng)西紅柿汁的添加量為10%時(shí)培養(yǎng)液的OD600值達(dá)到最大，故選擇西紅柿汁的添加量為10%。

2.3 低溫保護(hù)劑對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響結(jié)果

2.3.1 NaCl濃度對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響

不同濃度的NaCl對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響見圖6。

圖6 NaCl濃度對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響Fig.6 The effect of NaCl on freeze drying of Lactobacillus acidophilus

由圖6可知，添加NaCl后嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)較未添加NaCl活菌數(shù)高，說明NaCl溶液能夠提高嗜酸乳桿菌的抗凍性，其可能的原因是NaCl改變了菌泥的滲透壓，進(jìn)而改變了嗜酸乳桿菌細(xì)胞膜的通透性。當(dāng)NaCl濃度小于0.2%時(shí)，嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，但NaCl濃度大于0.2%時(shí)，活菌數(shù)逐漸降低，故最佳的NaCl濃度為0.2%。

2.3.2 脫脂乳粉濃度對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響

不同濃度的脫脂乳粉對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響見圖7。

圖7 脫脂乳粉濃度對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響Fig.7 The effect of skim milk powder on freeze drying of Lactobacillus acidophilus

由圖7可知，當(dāng)脫脂乳粉濃度小于10%時(shí)，嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，但脫脂乳粉濃度大于10%時(shí)，活菌數(shù)逐漸降低，故最佳的脫脂乳粉濃度為10%。脫脂乳粉對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的提高作用，可能是脫脂乳粉在菌體外能夠形成蛋白膜，加強(qiáng)了對(duì)菌體的保護(hù)作用。

2.3.3 甘油濃度對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響

甘油作為一類應(yīng)用較為普遍的凍干保護(hù)劑能夠有效維持生物大分子活性物質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)。不同濃度的甘油對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響見圖8。

圖8 甘油濃度對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響Fig.8 The effect of glycerin on freeze drying of Lactobacillus acidophilus

由圖8可知，當(dāng)甘油濃度小于2%時(shí)，嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，但甘油濃度大于2%時(shí)，活菌數(shù)逐漸降低，故最佳的甘油加入濃度為2%。

2.3.4 谷氨酸鈉濃度對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響

不同濃度的谷氨酸鈉對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響見圖9。

圖9 谷氨酸鈉濃度對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)的影響Fig.9 The effect of glycerin on freeze drying of Lactobacillus acidophilus

由圖9可知，當(dāng)谷氨酸鈉濃度小于2%時(shí)，嗜酸乳桿菌冷凍干燥后活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，但谷氨酸鈉濃度大于2%時(shí)，活菌數(shù)逐漸降低，故最佳的谷氨酸鈉加入濃度為2%。

2.4 增殖培養(yǎng)條件與低溫保護(hù)劑提高冷凍干燥后嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的正交試驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵和冷凍干燥都是提高嗜酸乳桿菌菌粉活菌數(shù)的非常重要的階段，為簡化工藝參數(shù)，探索出適合工業(yè)化生產(chǎn)和監(jiān)控的工藝流程，將嗜酸乳桿菌的增殖培養(yǎng)和冷凍干燥作為一個(gè)整體進(jìn)行考量，對(duì)活菌數(shù)影響較大的因素進(jìn)行綜合優(yōu)化。結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 1 Orthogonal test results and range analysis

由表1正交試驗(yàn)結(jié)果表明：接種量和脫脂乳粉的添加量對(duì)嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)及冷凍干燥過程中活菌影響效果較明顯，影響順序依次為接種量＞脫脂乳粉＞促進(jìn)劑用量＞甘油。最優(yōu)的低溫保護(hù)劑組合為A1B2C2D2，即促進(jìn)劑用量12%，接種量5%，脫脂乳粉10%，甘油2.0%，在此條件下嗜酸乳桿菌凍干菌粉的活菌數(shù)最高，達(dá)到了 8.9×1011cfu·g-1。

3 結(jié)論

嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)條件經(jīng)單因素優(yōu)化試驗(yàn)表明最優(yōu)的條件為：5%接種量，黃豆汁添加量為3%，西紅柿汁添加量為10%，靜止培養(yǎng)20 h，其活菌數(shù)達(dá)到1.84×1011cfu·g-1，接種量的大小對(duì)嗜酸乳桿菌增殖數(shù)量影響程度較其他因素大。黃豆汁、西紅柿汁分別作為主要氮源和主要生長因子補(bǔ)充劑對(duì)嗜酸乳桿菌的增殖具有一定的促進(jìn)作用，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定黃豆汁：西紅柿汁比例為3∶10。

嗜酸乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，添加一定量的NaCl、脫脂乳粉、甘油、谷氨酸鈉對(duì)嗜酸乳桿菌冷凍干燥過程中菌體存活率都具有一定程度的提高，其中添加10%脫脂乳粉和2.0%甘油較其他因素條件下嗜酸乳桿菌凍干菌粉的活菌數(shù)更高。

進(jìn)一步進(jìn)行嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)接種量和黃豆汁：西紅柿汁加入量及冷凍干燥保護(hù)劑對(duì)活菌數(shù)影響的正交試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)因素對(duì)活菌數(shù)影響順序依次為接種量＞脫脂乳粉＞促進(jìn)劑用量＞甘油。最優(yōu)的增殖培養(yǎng)條件和低溫保護(hù)劑組合為：促進(jìn)劑用量12%，接種量5%，脫脂乳粉10%，甘油2.0%，在此條件下嗜酸乳桿菌凍干菌粉的活菌數(shù)可達(dá)到8.9×1011cfu·g-1。