劉 露，邊巴窮達(dá)，閆洪雪，張鵬鵬，梁文輝，李 麗，趙宏濤

(1.海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266400；2.西藏自治區(qū)日喀則市桑珠孜區(qū)農(nóng)牧局，西藏日喀則 857000；3.青島明月藍(lán)海生物科技有限公司，山東青島 266400)

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1株巨大芽孢桿菌BM05發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉 露1，邊巴窮達(dá)2，閆洪雪1，張鵬鵬1，梁文輝3，李 麗1，趙宏濤3

(1.海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266400；2.西藏自治區(qū)日喀則市桑珠孜區(qū)農(nóng)牧局，西藏日喀則 857000；3.青島明月藍(lán)海生物科技有限公司，山東青島 266400)

[目的]優(yōu)化巨大芽孢桿菌BM05的發(fā)酵條件，提高其發(fā)酵活菌數(shù)。[方法]通過單因素試驗(yàn)篩選最佳碳、氮源，通過正交試驗(yàn)篩選最佳C/N比，并研究pH、發(fā)酵溫度、接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響。[結(jié)果]碳源選用玉米淀粉和葡萄糖，氮源選擇牛肉粉，初始pH 7.0，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量為4%，轉(zhuǎn)速220 r/min為最佳發(fā)酵條件。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵菌數(shù)達(dá)4.73×109cfu/mL，比原始配方提高了1.56倍。[結(jié)論]優(yōu)化后的發(fā)酵條件大大提高了巨大芽孢桿菌BM05的發(fā)酵活菌數(shù)。

巨大芽孢桿菌; 配方優(yōu)化；正交試驗(yàn)

解磷微生物可將土壤中的難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可吸收的物質(zhì)[1]，從而促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育。巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)是農(nóng)業(yè)上常用的解磷微生物，俗稱“大芽孢”磷細(xì)菌[2]，具有顯著的解磷功效[3]，是生產(chǎn)生物有機(jī)肥和微生物菌劑的常用菌種[4]。巨大芽孢桿菌BM05具有解磷作用，筆者通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期提高巨大芽孢桿菌BM05的發(fā)酵活菌數(shù)，同時(shí)降低生產(chǎn)成本。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。巨大芽孢桿菌BM05由海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2儀器。SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、YXQ-LS-70A型高壓蒸汽滅菌鍋(江蘇太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠)、THZ-D型搖床(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)和LRH-150B型培養(yǎng)箱(廣東韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)。

1.1.3培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：酵母粉6.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，葡萄糖6.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0。原始發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糊精 10.0 g/L，豆餅粉10.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MnSO40.2 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO31.0 g/L，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1不同碳源對(duì)菌數(shù)的影響試驗(yàn)。選用不同的碳源：麥芽糊精、糖蜜液、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉和玉米粉，濃度均為10.0 g/L，配方中其他成分同原始發(fā)酵培養(yǎng)基。接種量為2%，250 mL搖瓶裝液量為50 mL，搖床32 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，完全轉(zhuǎn)芽孢后利用涂平板計(jì)數(shù)法[5]測(cè)定發(fā)酵液中菌數(shù)，比較不同碳源對(duì)發(fā)酵活菌數(shù)的影響。

1.2.2不同氮源對(duì)菌數(shù)的影響試驗(yàn)。選用不同的氮源：豆餅粉、蛋白胨、脫脂豆粉、酵母粉、牛肉粉和玉米漿，濃度均為10.0 g/L，配方中其他成分同原始發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件不變。利用涂平板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液中菌數(shù)，比較不同氮源對(duì)發(fā)酵液中菌數(shù)的影響。

1.2.3不同C/N比對(duì)菌數(shù)的影響試驗(yàn)。以玉米淀粉、葡萄糖和牛肉粉作為因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，利用SPSS17.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中碳、氮源的濃度。培養(yǎng)基的其他成分同原始發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件不變。

1.2.4初始pH對(duì)菌數(shù)的影響試驗(yàn)。選擇初始pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，其他發(fā)酵條件為：溫度32 ℃，接種量2%，轉(zhuǎn)速180 r/min。

1.2.5發(fā)酵溫度對(duì)菌數(shù)的影響試驗(yàn)。發(fā)酵溫度選擇27、29、31、33、35、37和39 ℃，初始pH 7.0，接種量為2%，轉(zhuǎn)速180 r/min。

1.2.6接種量對(duì)菌數(shù)的影響試驗(yàn)。接種量選擇2%、4%、6%、8%和10%，發(fā)酵溫度為35 ℃，初始pH 7.0，轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.2.7轉(zhuǎn)速對(duì)菌數(shù)的影響試驗(yàn)。轉(zhuǎn)速選擇140、160、180、200、220和240 r/min，接種量為4%，發(fā)酵溫度為35 ℃，初始pH 7.0。

1.2.8新配方在發(fā)酵罐上的穩(wěn)定性考察。分別將原始配方、最優(yōu)配方及發(fā)酵條件在10 L發(fā)酵罐中(裝液量為6 L)進(jìn)行生產(chǎn)水平評(píng)估，設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn)，考察優(yōu)化配方的穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與分析

2.1不同碳源對(duì)菌數(shù)的影響由圖1可知，以玉米淀粉為碳源時(shí)，菌數(shù)明顯比其他碳源高，所以選擇玉米淀粉為碳源。

圖1　不同碳源對(duì)菌數(shù)的影響Fig.1　Effects of carbon sources on the bacterial count

2.2不同氮源對(duì)菌數(shù)的影響由圖2可知，以牛肉粉為氮源時(shí)，菌數(shù)明顯比其他氮源高，所以選擇牛肉粉為氮源。

圖2　不同氮源對(duì)菌數(shù)的影響Fig.2　Effects of nitrogen sources on the bacterial count

2.3不同C/N比對(duì)菌數(shù)的影響由表1、2可知，各因子對(duì)活菌數(shù)的影響大小順序?yàn)榕Ｈ夥?、葡萄糖、玉米淀粉。最佳培養(yǎng)基組分為玉米淀粉10.0 g/L，葡萄糖6.0 g/L，牛肉粉15.0 g/L。

表1不同C/N比對(duì)菌數(shù)影響的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 1Design of orthogonal test on effects of C/N ratio on the bacterial count

處理Treat-ment因素Factor玉米淀粉Cornstarchg/L葡萄糖Glucoseg/L牛肉粉Beefpowderg/L菌數(shù)Bacterialcount×108cfu/mL120610172105202632042029410615375156202862051536715510218154153391041018

2.4初始pH對(duì)菌數(shù)的影響由圖3可知，隨著pH的增加，菌數(shù)呈先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)pH為7.0時(shí)，巨大芽孢桿菌BM05芽孢整齊且菌數(shù)最高。

表2不同C/N比對(duì)菌數(shù)影響的正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 2Result of orthogonal test on effects of C/N ratio on the bacterial count

因素Factor均方MeansquareF值FvalueP>F玉米淀粉Cornstarch0.1110.0110.989葡萄糖Glucose0.7780.0770.929牛肉粉Beefpowder208.77820.6480.046

圖3　不同pH對(duì)菌數(shù)的影響Fig.3　Effects of pH value on the bacterial count

2.5發(fā)酵溫度對(duì)菌數(shù)的影響由圖4可知，隨著溫度升高，菌數(shù)呈先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，菌數(shù)最高。

圖4　不同溫度對(duì)菌數(shù)的影響Fig.4　Effects of temperature on the bacterial count

2.6接種量對(duì)菌數(shù)的影響由圖5可知，當(dāng)接種量為2%時(shí)，發(fā)酵時(shí)延遲期時(shí)間較長(zhǎng)，且總發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)；當(dāng)接種量為4%時(shí)，芽孢整齊，發(fā)酵菌數(shù)最高，接種量越高，延遲期越短，但發(fā)酵菌數(shù)越低，所以選擇接種量為4%。

圖5　不同接種量對(duì)菌數(shù)的影響Fig.5　Effects of inoculum size on the bacterial count

2.7轉(zhuǎn)速對(duì)菌數(shù)的影響由圖6可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，發(fā)酵活菌數(shù)最高，所以最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速設(shè)為220 r/min。

圖6　不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌數(shù)的影響Fig.6　Effects of rotation speed on the bacterial count

2.8新配方在發(fā)酵罐上的穩(wěn)定性通過上述試驗(yàn)，最優(yōu)配方為：玉米淀粉10.0 g/L，葡萄糖6.0 g/L，牛肉粉15.0 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MnSO40.2 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO31.0 g/L，pH 7.0。發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度35 ℃，接種量4%，轉(zhuǎn)速220 r/min。

將原始配方和新配方分別在10 L發(fā)酵罐上發(fā)酵。原始配方發(fā)酵30 h轉(zhuǎn)芽孢，芽孢率達(dá)90%，菌數(shù)為1.85×109cfu/mL；新配方進(jìn)行3次發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵穩(wěn)定，發(fā)酵28 h轉(zhuǎn)芽孢，芽孢率在95%以上，菌數(shù)為4.73×109cfu/mL，提高了1.56倍。

3　結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，巨大芽孢桿菌BM05的最優(yōu)發(fā)酵配方為：玉米淀粉10.0 g/L，葡萄糖6.0 g/L，牛肉粉15.0 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MnSO40.2 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCO31.0 g/L。發(fā)酵起始pH為7.0，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量4%，轉(zhuǎn)速220 r/min。通過發(fā)酵罐試驗(yàn)，發(fā)酵菌數(shù)從原始配方的1.85×109cfu/mL提高到4.73×109cfu/mL，提高了1.56倍。

巨大芽孢桿菌BM05配方中采用2種碳源和2種氮源共用的形式，葡萄糖和硫酸銨可縮短延遲期，玉米淀粉和牛肉粉的加入可供后期菌的生長(zhǎng)繁殖，且成本較低，通過正交試驗(yàn)合理了碳氮的比例，達(dá)到使BM05生長(zhǎng)的最優(yōu)水平。

對(duì)巨大芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化，李麗等[6]采用測(cè)OD的方式檢測(cè)菌生長(zhǎng)量，該研究直接采用測(cè)活菌數(shù)，結(jié)果更準(zhǔn)確。通過配方優(yōu)化，發(fā)酵活菌數(shù)明顯高于其他巨大芽孢桿菌[7-9]，為巨大芽孢桿菌菌肥的工廠化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1] 吳鵬飛，張冬梅，郝麗紅，等.解磷微生物研究現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2008，10(3)：40-46.

[2] 李阜棣，喻子牛，何紹江.磷細(xì)菌的分離與純化[M]//農(nóng)業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995：90-92.

[3] 鄭傳進(jìn)，黃林，龔明.巨大芽孢桿菌解磷能力的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24(2)：190-192.

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[5] 沈萍，陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，2010：28-34.

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[7] 王繼雯，劉瑩瑩，李冠杰，等.巨大芽孢桿菌C2產(chǎn)芽孢培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014(36)：155-160.

[8] 郭曉軍，李潞濱，李術(shù)娜，等.毛竹枯梢病拮抗細(xì)菌巨大芽孢桿菌6-59菌株的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2008，35(5)：443-447.

[9] 饒犇，王亞平，李娜，等.巨大芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(15)：3539-3542.

Optimization of Fermentation Condition ofBacillusmegateriumBM05

LIU Lu1, Penpa Chungdak2, YAN Hong-xue1et al

(1.State Key Laboratory of Bioactive Seaweed Substances, Qingdao, Shandong 266400; 2. Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Shigatse Sangzhuzi Area in Tibet Autonomous Region, Shigatse, Tibet 857000)

[Objective] To optimize the fermentation condition ofBacillusmegateriumBM05, and to enhance the fermented bacterial count. [Method] The optimal carbon source and nitrogen source were selected by single factor test, while the optimal carbon-nitrogen ratio was selected by orthogonal test. And the pH, fermentation temperature, inoculation quantity and rotation speed were also studied. [Result] Corn starch and glucose were the optimal carbon source and beef powder was the optimal nitrogen source. The optimal fermentation conditions were initial pH 7.0, 35 ℃ temperature, 4% inoculation quantity and 220 r/min rotation speed.BacillusmegateriumBM05 reached 4.73×109cfu/mL after the optimization of fermentation condition, which was 1.56 times higher than the control. [Conclusion] The optimized fermentation condition greatly enhances the fermented bacterial count ofBacillusmegateriumBM05.

Bacillusmegaterium; Formulation optimization; Orthogonal test

劉露(1987- )，女，山東濟(jì)南人，工程師，碩士，從事微生物應(yīng)用研究。

2016-05-31

Q 939.96

A

0517-6611(2016)21-024-03