張 瓊，甘懷勇，武世伍

全球每年新增食管癌病例約46萬，死亡約40萬，其死亡率居各種惡性腫瘤前列[1]。在我國食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中約90%的病例為食管鱗狀細胞癌。盡管近幾十年來各種新技術、新方法不斷發(fā)展，但食管癌病人總的生存時間并沒有明顯提高，術后轉移和復發(fā)是其主要原因。含WW結構域的氧化還原酶(WW domain-containing oxidoreductase，WWOX)是一種抑癌基因，該基因位于人染色體16q23.216q24.1。WWOX基因表達異常在多種腫瘤中均可出現，主要為雜合性缺失和甲基化[2]。細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1(extracellular signal regulated protein kinase 1，ERK1)是調節(jié)細胞生長、增殖及分裂信號網絡的關鍵分子，其通過磷酸化激活后可以從細胞質轉到細胞核，并通過誘導其上下游多種相關基因表達，從而促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移[3]。本研究主要通過免疫組織化學EliVisionTMplus法檢測150例食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)病人腫瘤組織中WWOX和ERK1蛋白的表達，分析其與ESCC病人臨床病理各參數之間的關系?，F作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床病理科2010年1月至2012年6月存檔石蠟包埋ESCC組織標本150例(術前未行任何放、化療及其他抗腫瘤治療)(ESCC組)和正常食管黏膜組織80例(對照組)，所有病人均有完整的臨床病理資料及隨訪資料，入選病人隨訪至病人死亡或截至2019年1月，根據隨訪者死亡及失訪時間設定隨訪時間為7～100個月。80例對照組食管黏膜組織均取自遠離ESCC腫塊>5.0 cm，且均經病理HE染色證實為正常食管黏膜組織。

1.2 試劑 兔抗人多克隆抗體WWOX購自美國Abcam公司；鼠抗人ERK1單克隆抗體購自美國Origen公司；EliVisionTMplus和DAB顯色試劑盒均購自中國福州邁新生物技術有限公司。

1.3 方法 所有ESCC標本經4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，于二甲苯溶液及梯度濃度的乙醇溶液中脫蠟至水洗。使用pH值6.0的0.1 mol/L枸櫞酸鈉作為修復液，高壓煮沸20 min，進行抗原修復。一抗原液以1∶100稀釋作為實驗濃度。免疫組織化學其他操作步驟均按試劑說明書進行，同時采用已知陽性片作對照，采用PBS液替代一抗作為空白對照。

1.4 評價標準 WWOX主要以細胞質內出現黃色或棕黃色顆粒為陽性著色；ERK1主要以細胞核出現黃色或棕黃色顆粒為陽性著色，細胞質也可以著色。陽性結果判定根據有關文獻[4]描述方法進行。以積分≥3分為陽性，<3分為陰性。免疫標記結果判定由兩位病理醫(yī)生采用獨立雙盲法得出。

1.5 統計學方法 采用χ2檢驗、Spearman相關分析、COX多因素分析及l(fā)og-rank檢驗。

2 結果

2.1 ESCC組和對照組WWOX、ERK1蛋白表達比較 ESCC組WWOX和ERK1蛋白的陽性表達率分別為46.0%(69/150)和58.7%(88/150)，與對照組的85.0%(68/80)和42.5%(34/80)差異均有統計學意義(χ2=32.96、5.47，P<0.05)(見圖1)。Spearman相關分析顯示，ESCC組織中WWOX表達與ERK1表達呈明顯負相關關系(r=-0.420，P<0.01)。

2.2 ESCC組織中WWOX、ERK1表達與臨床病理參數的關系 WWOX蛋白陽性率在不同TNM分期、組織浸潤深度和有無淋巴結轉移的ESCC病人間差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01)；ERK1蛋白陽性率在不同組織分化程度、浸潤深度、TNM分期和和有無淋巴結轉移的ESCC病人間差異均有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

2.3 ESCC病人生存預后的COX多因素分析 將ESCC病人的年齡、性別、腫瘤長徑、腫瘤位置、分化程度、淋巴結轉移、TNM分期、浸潤深度、WWOX表達、ERK1表達等因素納入COX多因素模型進行分析，結果顯示，WWOX和ERK1蛋白陽性表達和TNM分期是影響ESCC病人生存的獨立預后因素(P<0.05～P<0.01)(見表2)。

2.4 生存分析 本組病例總的5年生存率為26.7%(40/150)。WWOX蛋白陽性組與陰性組的中位生存時間分別為56.0(35.0，72.0)個月和28.0(18.0，54.5)個月，差異有統計學意義(χ2=3.92，P<0.05)；ERK1蛋白陽性組與陰性組的中位生存時間分別為29.5(19.0，51.3)個月和56.5(38.0，74.3)個月，差異無統計學意義(χ2=2.27，P>0.05)。

表1 不同臨床病理參數ESCC病人的WWOX和ERK1蛋白表達比較(n)

表2 ESCC病人生存預后的COX多因素分析

3 討論

WWOX基因是一個跨越脆性位點16D的大型基因[5]，該基因是抑癌基因，它編碼一個WWOX蛋白，在細胞凋亡、細胞代謝以及調節(jié)多種相互作用的轉錄因子方面發(fā)揮重要作用[6-8]。WWOX蛋白在大部分正常組織中強表達，但是在多種癌組織中卻表達降低或缺失，包括乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、食管癌以及白血病等[6,9-12]。本研究通過免疫組織化學法檢測WWOX蛋白在ESCC組織及癌旁正常食管黏膜組織中的表達，結果顯示，ESCC組織中WWOX蛋白陽性率明顯低于對照組；而在ESCC組織中，隨著浸潤越深，WWOX蛋白陽性率降低，淋巴結有轉移病人的ESCC組織中WWOX蛋白陽性率低于淋巴結無轉移者，TNM分期增高，WWOX蛋白陽性率降低。Kaplan-Meier生存分析顯示，在WWOX蛋白陽性表達的ESCC病人總生存時間高于其表達陰性者。上述結果提示WWOX的異常表達參與了ESCC的增殖、浸潤及轉移，且其表達降低意味著病人的預后不良，與相關文獻[13]報道一致。

ERK1是MAPK信號通路中的關鍵成分，其具有絲氨酸/蘇氨酸激酶特性，只有當其磷酸化后(p-ERK)才具有活性，而ERK1活化與否決定其在細胞增殖方面發(fā)揮的作用[14]。磷酸化的ERK1由細胞質進入細胞核內，從而激活其上下游相關的基因轉錄，促進細胞的增殖及抑制凋亡，導致細胞異常增殖而最終形成腫瘤。最近有研究者[15]在腦膠質母細胞瘤研究中發(fā)現ERK1明顯增強，可導致腫瘤細胞異常增生，促進腫瘤生長。有學者[16]研究顯示，用二氟甲基鳥氨酸(DFMO)可抑制NMBA誘導的p38α，ERK1/2和AKT/mTOR/p70S6K途徑的激活。在NMBA誘導的大鼠模型中，發(fā)現DFMO可抑制ERK1通路，并在這些大鼠中被下調，從而進一步阻礙食管鱗狀上皮不典型增生向浸潤性癌的發(fā)展。還有學者[17]發(fā)現ESCC中的NONO蛋白水平顯著上調，使用siRNA進行NONO耗竭可顯著抑制ESCC細胞的增殖，侵襲并促進其凋亡，因為敲低NONO可以降低磷酸化Akt和ERK1的蛋白質水平。此外，ERK1還能促進腫瘤細胞的運動及誘導血管形成，從而促進腫瘤的復發(fā)與轉移。本研究結果顯示，ERK1蛋白在ESCC組織中陽性率高于對照組；且在ESCC組織中，隨著ESCC的分化越差、浸潤越深、TNM分期越高，ERK1的陽性率越高，淋巴結有轉移病人的ERK1陽性率亦高于淋巴結無轉移者；生存分析結果也顯示，ERK1陽性ESCC病人的總生存時間低于ERK1陰性者。提示ERK1的反常激活促進了ESCC的發(fā)生、增殖、浸潤及轉移，且其陽性表達往往表明病人預后差[18]。

本研究中，Spearman相關分析顯示，ESCC組織中WWOX與ERK1表達呈負相關關系。WWOX的表達異常降低或缺失，導致其誘導細胞凋亡的功能喪失，促使細胞異常增殖而導致ESCC的發(fā)生。ERK1的異常激活則進一步促進了ESCC發(fā)生及增殖[19]，其還可以促進MMP的表達而降解基底膜及誘導腫瘤血管形成，最終導致ESCC的浸潤及轉移。COX多因素分析顯示，WWOX和ERK1蛋白陽性表達及TNM分期是影響ESCC病人術后生存時間的獨立預后因素。

綜上所述，WWOX和ERK1在ESCC組織中的反常表達與ESCC的發(fā)生、增殖、浸潤及轉移相關，ESCC病人早期檢測WWOX和ERK1蛋白表達，可作為預測ESCC病人浸潤及轉移的指標之一。