趙如華 宋佳悅 趙曉蕊 趙檸 房濤 張靜 吳靖芳

(1河北北方學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室，河北 張家口 075000；2張家口市第一醫(yī)院)

肺癌是最常見的惡性腫瘤疾病，全世界每年有將近1.4千萬人死于肺癌〔1〕，是發(fā)病率和死亡率增長最快，對生命威脅最嚴重的惡性腫瘤之一。非小細胞肺癌是肺癌主要類型，約占肺癌患者的85%〔2〕。近幾年肺癌發(fā)病率逐年升高，在男性惡性腫瘤發(fā)病率中占第一位，在女性占第二位，肺癌易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，是引起中老年腫瘤患者死亡的主要原因〔3〕，因此研究肺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移機制對探討肺癌的靶向治療和有效的候選診斷標志物具有臨床意義。三葉因子(TFF)3是TFF家族重要成員，近幾年研究表明TFF3在多種腫瘤中高表達，與腫瘤細胞的生長、播撒、轉(zhuǎn)移和遷移有密切關(guān)系。核因子(NF)-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，它被異常激活后可通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的異常表達而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)TFF3能夠激活腸上皮細胞中NF-κB，并通過NF-κB 抑制細胞凋亡〔5〕。本研究旨在探討TFF3對人非小細胞肺癌A549細胞NF-κB表達變化的影響，通過慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞建立穩(wěn)定過表達和敲低TFF3表達的A549細胞株，探討NF-κB、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、B細胞淋巴瘤基因(Bcl)-2表達變化意義。

1 材料與方法

1.1材料 人非小細胞肺癌A549細胞購自中國科學(xué)院細胞庫(SCSP-503)，F(xiàn)12K培養(yǎng)基、DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司，293T細胞、TFF3增強及沉默質(zhì)粒由河北北方學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗室提供，Lenti-PacTM慢病毒包裝試劑盒購自廣州復(fù)能基因有限公司。Trizol、FastQuant RT Kit (With DNase)cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技有限公司，PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購自Thermo Fisher Scientific有限公司，DNA marker(DM2000)購自康為世紀生物科技有限公司。蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，小鼠抗人β-actin抗體、羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G、羊抗兔IgG購自康為世紀生物科技有限公司，小鼠抗人NF-κB p65抗體購自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司，兔抗人TFF3抗體購自Abcam生物公司，兔多抗Bcl-2購自武漢博士德生物工程有限公司，兔多抗CyclinD1購自Santa Cruz公司，超敏ExPlus ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，PCR引物通過NCBI-Primer-BLAST設(shè)計并驗證，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2細胞培養(yǎng) A549、293T細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F12K、DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)(Thermo Fisher)培養(yǎng)，每隔2～3 d更換一次培養(yǎng)基，待細胞匯合80%～90%時1∶2或1∶3進行傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗操作。

1.3慢病毒包裝TFF3增強和沉默質(zhì)粒 慢病毒包裝前，293T細胞按5×104個/孔接種于24孔板內(nèi)，加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃的條件下鋪板培養(yǎng)細胞，達到70%～80%融合率時進行慢病毒包裝。將TFF3基因全長慢病毒表達載體質(zhì)粒(TFF3)及對照(Vec)、TFF3小發(fā)卡RNA慢病毒表達載體的質(zhì)粒(shTFF3)及對照(shCK)、eGFP 陽性對照質(zhì)粒按照說明書制備DNA-EndoFectin轉(zhuǎn)染復(fù)合物并加入孔板中，在5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)12 h后，去除含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的舊培養(yǎng)液，每孔添加500 μl含5%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，并加入1 μl TiterBoost增強劑，繼續(xù)在5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)36 h后收集細胞培養(yǎng)液，以500 r/min離心10 min去除細胞碎片，吸取上清獲得慢病毒液。根據(jù)實驗室慢病毒包裝經(jīng)驗，以慢病毒液與培養(yǎng)基1∶3比例加入前1 d已于24孔板按1×105個/孔鋪好的A549細胞中過夜，24 h后去除慢病毒液加入F12K全培養(yǎng)基，48 h后可見eGFP陽性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)綠色熒光，再培養(yǎng)48 h后加入含2 μg/ml嘌呤霉素的F12K培養(yǎng)基進行篩選，每隔3 d換液，2 w后獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，并通過qRT-PCR和Western印跡進行驗證。

1.4實時熒光定量PCR法檢測目的基因的表達水平 將鋪滿25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)A549-TFF3、A549-Vec、A549-shTFF3、A549-shCK四株細胞胰酶消化后置滅酶EP管中，Trizol法分別提取四株細胞的總RNA，Nanodrop(Thermo Fisher)測定RNA濃度，根據(jù)說明書按照1 μg總RNA模板量進行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)液(總體系10 μl，cDNA原液1∶10稀釋后取1 μl，上下游引物各0.5 μl，PCRMix：5 μl，ddH2O：3 μl)，而后通過ABI7300實時熒光PCR儀進行PCR反應(yīng)，程序設(shè)置如下：①UDG酶激活(50℃，2 min)，②預(yù)變性(95℃，2 min)，③變性(95℃，15 s)，④退火/延伸(60℃，1 min)，第3、4步總共40個循環(huán)，采用2-ΔΔCT方法計算相對表達量。TFF3基因PCR產(chǎn)物加入4×DNA上樣緩沖液后進行1.5%瓊脂糖凝膠水平電泳并通過Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和拍照。引物序列：β-actin上游5′-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3′ 、下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATAC-3′；NF-κB上游5′-AAATGGGCTACACCGAAGCA-3′、下游5′-TTGCGGAAGGATGTCTCCAC-3；Bcl-2上游5′-TCCGCATCAGGAAGGCTAGA-3′ 、下游5′-AGGACCAGGCCTCCAAGCT-3′；CyclinD1上游5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′ 、下游5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′ 。

1.5Western印跡蛋白檢測 消化、洗滌、收集A549-TFF3、A549-Vec、A549-shTFF3、A549-shCK四株細胞后加入0.5 ml細胞裂解液，4°靜置2 min，而后加入1 ml抽提試劑，振蕩混勻，4℃靜置10 min，10 000 r/min 4℃離心10 min，保留中間蛋白膜，加入1 ml純乙醇洗滌沉淀。10 000 r/min 4℃離心3 min，室溫空氣干燥蛋白沉淀，視蛋白膜大小加入200～500 μl 2%SDS 95℃金屬浴溶解蛋白膜，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，計算含30 μg蛋白的體積數(shù)，加入4×上樣緩沖液與ddH2O補足至10 μl，配制上樣蛋白混合液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜孵育一抗：β-actin(1∶3 000)、TFF3(1∶1 000)、NF-κB(1∶500)、Bcl-2(1∶200)、CyclinD1(1∶500)4℃過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，二抗(1∶5 000)室溫下?lián)u床1 h，PBST清洗3次，膜上蛋白面滴加ECL發(fā)光顯色液顯影，通過OmegaLum W(Aplegen，美國)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和拍照。Image J分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白/β-actin的比值為該蛋白的相對表達量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1慢病毒轉(zhuǎn)染后穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立 慢病毒液轉(zhuǎn)染96 h后用含2 μg/ml嘌呤霉素的F12K培養(yǎng)基進行篩選，7 d后eGFP對照組細胞90%以上為綠色熒光(圖1)，再繼續(xù)篩選7 d獲得的細胞進行PCR及Western印跡TFF3 mRNA及蛋白表達水平的鑒定。結(jié)果顯示A549-TFF3細胞TFF3 mRNA較Vec組顯著增高(655.00±135.00 vs 1.00±0.04，P<0.01)，瓊脂糖水平電泳觀察TFF3條帶明顯亮于Vec組，蛋白水平較Vec組顯著增高(3.39±0.05 vs 0.88±0.05，P<0.01)。A549-shTFF3細胞株中TFF3 mRNA沉默效率約為75%，瓊脂糖水平電泳顯示TFF3條帶明顯弱于shCK組(0.25±0.03 vs 1.00±0.05，P<0.01)，shTFF3蛋白水平較shCK組明顯降低(0.20±0.03 vs 0.80±0.05，P<0.01)，見圖2，圖3。

2.2NF-κB mRNA、Bcl-2 mRNA、CyclinD1 mRNA相對表達量變化 與Vec組相比，TFF3組A549細胞中NF-κB、Bcl-2 、CyclinD1 mRNA水平表達明顯增高，與shCK組比較，而shTFF3組NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA水平均明顯降低(均P<0.01)。見表1。

M：marker

圖3 Western印跡驗證TFF3蛋白表達水平

表1 TFF3對A549細胞相關(guān)分子基因水平的影響

2.3NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白在過表達及沉默TFF3基因的A549細胞中的表達變化 TFF3組NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白表達水平均明顯高于Vec組(P<0.05，P<0.01)，而在shTFF3組蛋白表達水平明顯著低于shCK組(P<0.01)。見表2，圖4。

表2 TFF3對A549細胞相關(guān)分子蛋白水平的影響(平均灰度值，

圖4 TFF3對A549細胞NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白表達水平的影響

3 討 論

肺癌是最常見的惡性腫瘤，被確診的病例逐年增多，5年生存率低于15%，而且復(fù)發(fā)率較高〔6〕，非小細胞肺癌是肺癌中主要類型，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，5年生存率很低。肺癌惡性屬性的潛在機制尚未闡明，因此缺乏有效地治療。研究非小細胞肺癌惡性發(fā)生發(fā)展機制對尋找有價值的腫瘤標志物、疾病治療、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷均具有重要的臨床意義。大量增加的證據(jù)表明TFF3在多種腫瘤中高表達，包括乳腺癌〔7〕、胃癌〔8〕、結(jié)腸癌〔9〕、肝癌〔10〕、前列腺癌〔11〕、甲狀腺癌〔12〕等，高表達的TFF3促進了腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為。TFF3最初被證實是重要的消化道黏膜保護因子，主要由腸道杯狀細胞所分泌，在胃腸道黏膜受到損傷后TFF3分泌的增加促進細胞的增殖和遷移從而有利于黏膜的修復(fù)〔13〕，當(dāng)TFF3異常過多增加時將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。有實驗表明，TFF3在肺癌患者血清中明顯增高，可作為肺癌的生物學(xué)標記物〔14〕。本研究結(jié)果表明，慢病毒轉(zhuǎn)染的方法能夠通過病毒介導(dǎo)顯著提高基因的轉(zhuǎn)染效率，實現(xiàn)目的基因的高效表達。

NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在刺激因素作用下，由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)為激活狀態(tài)，胞質(zhì)中的NF-κB進入細胞核中與相應(yīng)基因的啟動子或增強子的特異性NF-κB元件結(jié)合，調(diào)控下游靶基因蛋白的表達而發(fā)揮相應(yīng)的功能，包括增殖調(diào)節(jié)基因(CyclinD1 、C-myc等)、凋亡相關(guān)基因(Bcl-xl、Bcl-2等)等，參與調(diào)控細胞生長、分化、增殖、凋亡、血管生成等過程，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、抵抗治療的過程密切相關(guān)〔15～17〕。研究表明TFF3能夠激活腸細胞中NF-κB，并能夠抵抗凋亡〔18〕。本研究結(jié)果提示在A549細胞中TFF3基因能夠激活NF-κB的表達，進而誘導(dǎo)下游基因的進一步表達。CyclinD1是目前研究最多的細胞周期蛋白，是調(diào)節(jié)G1-S期轉(zhuǎn)換的重要因子，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔19〕，CyclinD1表達增加時，G1期縮短，促進細胞進入S期，細胞處于持續(xù)增殖的狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤的形成。CyclinD1是NF-κB的重要靶基因，其啟動子上含有兩個與NF-κB結(jié)合的位點，NF-κB的激活可CyclinD1的高表達，促進腫瘤細胞的增殖〔20〕。本實驗結(jié)果進一步證實CyclinD1與NF-κB的表達變化是一致的，高表達的NF-κB促進了CyclinD1的激活，促進腫瘤細胞的生長，而沉默TFF3的A549細胞中NF-κB水平降低，CyclinD1表達減弱，引起細胞周期阻滯，促進細胞凋亡的發(fā)生，CyclinD1表達水平的降低還可能與細胞周期依賴性激酶(CDKs)抑制因子P21、P27被激活有關(guān)，抑制了CDKs復(fù)合物對細胞周期的調(diào)控，抑制細胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)變。Kannan等〔21〕研究表明TFF3可通過上調(diào)Bcl-2表達促進乳腺癌細胞克隆性生長，NF-κB可激活含有κB的Bcl-2和Bcl-XL編碼基因的轉(zhuǎn)錄活性，增強腫瘤細胞的抗凋亡能力，因此通過本實驗結(jié)果推測過表達的TFF3可能通過上調(diào)NF-κB活性促進Bcl-2的表達，增強了A549細胞的抗凋亡能力，促進了癌細胞的生長。綜上，TFF3可通過NF-κB通路影響非小細胞肺癌A549細胞的細胞周期、細胞凋亡的進程。