侯從嶺 雷小婷 蘆曉帆 周超鋒 李彬

(1河南省中醫(yī)院肺病科，河南 鄭州 450002；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院肺病科；3河南省中醫(yī)院腫瘤科)

肺癌發(fā)病率和死亡率在世界各地均在上升，肺癌的發(fā)生與吸煙飲酒密切相關(guān)〔1〕。大多肺癌患者確診時已是晚期，癌癥已發(fā)生轉(zhuǎn)移，腦轉(zhuǎn)移患者平均生存時間僅1～2個月，放化療等方法預(yù)后較差，患者負擔(dān)重〔2〕。中藥因可延長患者生存期并改善患者生存質(zhì)量，已成為肺癌治療的重要組成部分〔3〕。槐角黃酮可能通過上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3及下調(diào)B細胞淋巴瘤(Bcl)-2來抑制人胰腺癌細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡〔4〕。與癌旁組織相比，miR-188-5p在胃癌組織、前列腺癌和肝癌組織及細胞中表達下調(diào)，過表達miR-188-5p可顯著抑制癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移或促進癌細胞凋亡〔5～7〕。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)5在肺癌、胃癌及肝癌組織和細胞中表達上調(diào)，干擾或下調(diào)PRMT5表達可抑制癌細胞的增殖〔8～10〕。但槐角黃酮對肺癌細胞的影響及機制尚不清楚。本研究以人肺癌細胞系A(chǔ)549為研究對象，研究槐角黃酮對肺癌的影響及miR-188-5p和PRMT5在此機制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞株A549購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；槐角購自中藥批發(fā)市場；胰蛋白酶Trypsin、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亞砜(DMSO)和四氮唑藍(MTT)購自Sigma-Aldrich公司；F-12K培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；Transwell板購自美國Corning公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑Trizol、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；抗PRMT5抗體、細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、p21抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、抗MMP-9抗體和抗GAPDH抗體購自Abcam；顯微鏡、發(fā)光儀、酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國BD公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自Thermo。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、藥物處理 細胞培養(yǎng)：A549細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青-鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基中，置于濕度保持95%、37℃且5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化傳代。藥物處理：槐角黃酮采用文獻〔11〕方法提取和制備。將槐角黃酮以10 mg/ml的質(zhì)量濃度溶解于F-12K培養(yǎng)基中，并稀釋成1 mg/ml和5 mg/ml，過濾除菌。96孔板培養(yǎng)細胞至貼壁狀態(tài)，將培養(yǎng)液吸出，換為含不同濃度槐角黃酮的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，收集細胞進行實驗。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 將傳代后的A549細胞用培養(yǎng)液稀釋至(1～2)×106個細胞/ml，以2×105細胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)細胞至融合度為80%～90%，進行轉(zhuǎn)染。取等體積用無血清培養(yǎng)液稀釋的脂質(zhì)體和各組片段及載體，混合均勻，室溫孵育20 min，加入到培養(yǎng)好的A549細胞中，混勻，培養(yǎng)6 h，換為F-12K完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞，進行實驗。

1.2.3Real-time PCR檢測mRNA的表達 收集各組轉(zhuǎn)染或(和)槐角黃酮處理的A549細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，合成cDNA，合成的cDNA測定濃度和純度后置于-80℃保存。取cDNA按照real-time PCR的說明書進行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：94℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 45 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃10 min。引物如下：miR-188-5p：5′-CATCCCTTGCATGGTGGAGGG-3′；PRMT5上游：5′-CCTGTGGAGGTGAACACAGT-3′，下游：5′-AGAGGATGGGAAACCATGAG-3′。運用Bio-Rad PCR系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4MTT實驗檢測細胞增殖 收集轉(zhuǎn)染或處理后的A549細胞，消化，稀釋細胞，以2×103個/孔接種于96微孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h時進行MTT實驗，每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT，培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)上清，每孔再加入150 μl DMSO，室溫混勻5 min，酶標(biāo)儀測定490 nm 吸光度(A)值。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 遷移實驗：將轉(zhuǎn)染或處理后的各組A549細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細胞，加入含10 g/L BSA的無血清F-12K培養(yǎng)基，將細胞稀釋為2×105個/ml。Transwell下層培養(yǎng)孔加入500 μl含10%FBS的F-12K培養(yǎng)基，Transwell上層小室中加入100 μl細胞，將上層小室放入下層培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)48 h，取出用棉簽拭去基質(zhì)膠和上層小室的細胞，冰甲醛固定細胞，染色，顯微鏡計數(shù)。侵襲實驗：以4℃無血清培養(yǎng)基1∶3比例稀釋Matrigel，加入上層Transwell小室，烘干，以下步驟同遷移實驗，上層加入100 μl稀釋的細胞，下層加入500 μl含10%FBS的F-12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，固定細胞，染色，計數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 A549細胞轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞，Trypsin消化，計數(shù)，以1×104個細胞/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24～48 h，觀察若細胞融合度達到80%～90%，進行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的PRMT5的野生型(WT-PRMT5)和突變型(MUT-PRMT5)雙熒光素酶報告載體分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-188-5p，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細胞，加入裂解液室溫裂解30 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡實驗 將轉(zhuǎn)染48 h后的各組A549細胞用放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液裂解，超聲破碎細胞，收集蛋白并檢測濃度。將蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別加入一抗，抗PRMT5抗體(1∶1 000)、CyclinD1抗體(1∶500)、p21抗體(1∶800)、抗MMP-2抗體(1∶500)、抗MMP-9抗體(1∶800)和抗GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。洗膜2次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1槐角黃酮對肺癌A549細胞增殖和遷移侵襲的影響 與對照組相比，槐角黃酮1 mg/ml組、5 mg/ml組和10 mg/ml組肺癌細胞A549的增殖蛋白CyclinD1表達明顯下降，p21表達明顯上升，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達顯著下降，細胞抑制率顯著上升，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著下降(均P<0.05)，且呈現(xiàn)顯著的劑量依賴趨勢。見圖1，圖2，表1。

圖1 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達

圖2 槐角黃酮對肺癌A549細胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶柴染色，×200)

表1 槐角黃酮對肺癌A549細胞增殖和遷移侵襲的影響

2.2槐角黃酮對肺癌A549細胞中miR-188-5p和PRMT5表達的影響 與對照組相比，槐角黃酮1 mg/ml組、5 mg/ml組和10 mg/ml組A549細胞中miR-188-5p表達水平顯著上升，PRMT5 mRNA和蛋白表達量顯著下降(均P<0.05)。見表2，圖3。

表2 槐角黃酮對肺癌A549細胞中miR-188-5p和PRMT5表達的影響

圖3 Western印跡檢測PRMT5蛋白表達

2.3miR-188-5p靶向調(diào)控PRMT5的表達 PRMT5的3′-UTR序列中含有與miR-188-5p互補的核苷酸序列，見圖4A。與miR-NC組(1.00±0.09，n=6)相比，miR-188-5p組野生型WT-PRMT5的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(0.32±0.03，n=6，t=17.558,P=0.000)；而突變型MUT-PRMT5的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化(miR-NC組0.98±0.08、miR-188-5p組0.99±0.09，n=6，P>0.05)。與miR-NC組(0.61±0.03,n=12)相比，miR-188-5p組的PRMT5蛋白表達量顯著下降(0.23±0.03,n=12,P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.60±0.06，n=12)相比，anti-miR-188-5p組的PRMT5蛋白表達量顯著上升(0.95±0.08，n=12，P<0.05)，見圖4B。

2.4miR-188-5p過表達可抑制肺癌A549細胞增殖和遷移侵襲 與miR-NC組相比，miR-188-5p組的miR-188-5p表達量顯著升高，增殖蛋白CyclinD1表達下降，增殖抑制蛋白p21表達明顯上升，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達顯著下降，細胞增殖抑制率顯著上升，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著下降(P<0.01，P<0.001)。見圖5，表3。

A：PRMT5的3′UTR中含有與miR-188-5p互補的核苷酸序列；B：PRMT5蛋白表達

圖5 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達

表3 miR-188-5p過表達對肺癌A549細胞增殖和遷移侵襲的影響

2.5抑制PRMT5表達可抑制肺癌A549細胞增殖和遷移侵襲 與si-NC組相比，si-PRMT5組的PRMT5蛋白表達顯著下降，增殖蛋白CyclinD1表達顯著下降，增殖抑制蛋白p21表達顯著上升，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達顯著下降，細胞增殖抑制率顯著上升，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著下降(均P<0.001)，見表4,圖6。

表4 抑制PRMT5表達對肺癌A549細胞增殖和遷移侵襲的影響

圖6 PRMT5和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達

2.6抑制miR-188-5p表達逆轉(zhuǎn)了槐角黃酮(10 mg/ml)對肺癌A549細胞增殖和遷移侵襲的作用 與對照組相比，槐角黃酮(10 mg/ml)組的A549細胞PRMT5蛋白表達量顯著上升，增殖蛋白CyclinD1表達顯著下降，增殖抑制蛋白p21表達顯著上升，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達顯著下降，細胞增殖抑制率顯著上升，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著下降(均P<0.05)；與槐角黃酮組+anti-miR-NC組相比，槐角黃酮組+anti-miR-188-5p組的A549細胞PRMT5蛋白表達量顯著下降，增殖蛋白CyclinD1表達上升，增殖抑制蛋白p21表達降低，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達顯著上升，細胞增殖抑制率顯著降低，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著上升(均P<0.05)。見圖7，表5。

1～4：對照組、槐角黃酮組、槐角黃酮+anti-miR-NC組、槐角黃酮+anti-miR-188-5p組

表5 抑制miR-188-5p表達逆轉(zhuǎn)了槐角黃酮對肺癌A549細胞增殖和遷移侵襲的作用

3 討 論

肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因，75%的患者在確診時已發(fā)展為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)，2014年英國國家統(tǒng)計局報告稱，遠處轉(zhuǎn)移性肺癌(Ⅳ期)患者1年生存率僅為15%～19%〔12〕。盡管肺癌的診斷和治療(手術(shù)、放療、化療和靶向治療)有很大進步，但是晚期患者預(yù)后仍然很差〔11〕。中藥在治療肺癌中起著越來越重要的作用，通過提高患者免疫力，改善微循環(huán)，抑制腫瘤新生血管形成及促進細胞凋亡等，達到控制和抑制腫瘤的作用，改善放化療的不良反應(yīng)，提高患者生存質(zhì)量〔13〕。但中藥對肺癌的分子抑制機制，尚不完全清楚。

槐角是豆科植物槐(Sophora japonica L)的果實，具有涼血止血的功效，槐角富含異黃酮類化合物，對骨質(zhì)疏松和癌癥等具有較好的預(yù)防和治療作用，其中的化合物包括染料木素、槐屬苷、染料木苷、槐屬雙苷、刺芒柄花素、刺芒柄花苷、大豆苷等，其中的染料木素在合適的濃度對肺癌A549和胃腺癌BGC-823細胞抑制率分別可達82%和91%〔14〕?；苯寝D(zhuǎn)化產(chǎn)物染料木素和異櫻黃素對乳腺癌細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用〔15〕，槐角黃酮對胰腺癌也有顯著的抑制作用〔4〕。本研究發(fā)現(xiàn)，槐角黃酮可抑制肺癌細胞A549的侵襲、遷移和增殖，且呈顯著的劑量依賴性，又一次驗證了槐角黃酮的抗腫瘤作用。

miR-188能產(chǎn)生miR-188-5p和miR-188-3p兩種miRNA，在多種腫瘤組織中表達異常，調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Zhang等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-188-5p在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中表達下調(diào)，過表達miR-188-5p可通過抑制LAPTM4B抑制磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路，抑制前列腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。Wang等〔17〕最新發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織和細胞中，miR-188-5p表達異常升高，miR-188-5p通過上調(diào)癌基因婆羅雙樹轉(zhuǎn)錄因子(SALL)4，促進胃癌細胞增殖和遷移，同時抑制抑癌基因PTEN(第10號染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因)表達。本研究發(fā)現(xiàn)，槐角黃酮可促進A549中miR-188-5p的表達，過表達miR-188-5p可以抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲，與Zhang等〔16〕研究結(jié)果類似；抑制miR-188-5p可逆轉(zhuǎn)槐角黃酮對A549細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，說明miR-188-5p在槐角黃酮的抑癌機制中發(fā)揮作用。

此外，本研究通過Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PRMT5的3′-UTR序列中含有與miR-188-5p互補的核苷酸序列，預(yù)示miR-188-5p與PRMT5之間可能存在結(jié)合位點或者調(diào)控關(guān)系。PRMT5可能參與槐角黃酮對肺癌A549的抑制機制。PRMT5是蛋白-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族中的一員，它形成獨特的同質(zhì)寡聚體，主要位于細胞質(zhì)，催化蛋白中精氨酸殘基對稱二甲基化的形成，與維持干細胞干性有關(guān)，腫瘤干細胞的出現(xiàn)有助于耐藥性的形成〔18〕。PRMT5通過調(diào)控乳腺癌干細胞來決定其對化療藥物的敏感性〔19〕，同時其也是膠質(zhì)母細胞瘤的藥物治療靶點〔20〕。Sheng等〔21〕發(fā)現(xiàn)，PRMT5在肺癌和前列腺癌中通過調(diào)控編碼生長和抗生長因子的一組特定基因的表達，包括受體酪氨酸激酶和抗增殖蛋白，進而調(diào)控癌細胞的增殖。Jing等〔22〕總結(jié)大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRMT5作為潛在的致癌基因，通過組蛋白和其他蛋白甲基化參與細胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡，對肺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，其高表達通常提示肺癌臨床預(yù)后較差。Jing等〔23〕研究表明，PRMT5 在人肺癌組織中經(jīng)常高表達，其通過組蛋白H4R3的對稱二甲基化抑制miR-99家族的轉(zhuǎn)錄，從而增加FGFR3的表達，進而激活Erk1/2和Akt，導(dǎo)致肺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移，敲除PRMT5可通過阻斷miR-99家族的組織學(xué)修飾抑制肺癌轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致。說明槐角黃酮通過抑制PRMT5表達抑制肺癌。

此外，本研究證實在肺癌A549細胞中miR-188-5p和PRMT5之間具有調(diào)控關(guān)系，也說明槐角黃酮通過miR-188-5p靶向抑制PRMT5進而抑制肺癌。