安和兵， 陳 珊， 馬媛媛， 張俊婷， 王書(shū)旺， 楊建寶, 楊敬芳*

(1.河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科， 河北 張家口 0751002.河北省張家口市宣鋼醫(yī)院檢驗(yàn)科， 河北 張家口 075100)

目前，慢性乙型肝炎病毒感染所導(dǎo)致的相關(guān)性疾病仍然是我國(guó)所面臨的主要健康問(wèn)題之一，乙肝表面抗原攜帶者在我國(guó)人群中的占有率達(dá)9.45%[1]，預(yù)防和控制慢性HBV感染并阻斷其流行最有效的措施和手段是對(duì)新生兒進(jìn)行及時(shí)和全程乙肝疫苗接種和對(duì)學(xué)齡前兒童進(jìn)行乙肝五項(xiàng)的篩查，我國(guó)是乙肝高地方性流行地區(qū),1992年將乙肝疫苗納入兒童預(yù)防接種管理,2002年納入國(guó)家免疫規(guī)劃預(yù)防接種程序,新生兒乙肝疫苗接種率接近100%，通過(guò)國(guó)家研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析，乙肝病毒感染率呈逐年下降趨勢(shì)[2,3]，隨著乙肝疫苗的普遍接種，以及乙肝檢測(cè)儀器靈敏度的提高，在臨床上出現(xiàn)了一些乙肝表面抗原低滴度陽(yáng)性的患者，給大夫?qū)颊咭腋渭膊〉脑\斷產(chǎn)生了誤區(qū)，是按乙型肝炎進(jìn)行治療還是進(jìn)一步觀察，猶豫不決，如果治療怕產(chǎn)生誤診造成不必要的用藥，如果進(jìn)一步觀察又怕延誤了患者的最佳治療時(shí)間。本課題通過(guò)對(duì)這些注射了乙肝疫苗后產(chǎn)生乙肝表面抗原低滴度陽(yáng)性患者的臨床研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出科學(xué)的結(jié)論，為大夫?qū)σ腋渭膊〉脑缙谠\斷提供理論依據(jù)。具體如下：

1 資料與方法

1.1一般資料:選取本院2016年至2019年兒科病房和免疫門(mén)診0～1歲嬰幼兒接種乙肝疫苗2周內(nèi)化學(xué)發(fā)光微粒子法檢測(cè)HBsAg，選取193例HBsAg低滴度高陽(yáng)性率的血清標(biāo)本作為研究對(duì)象進(jìn)行研究，同時(shí)再對(duì)這193例陽(yáng)性0～1歲嬰幼兒半年以后用同樣的檢測(cè)方法進(jìn)行HBsAg的復(fù)檢，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率，并通過(guò)對(duì)疫苗濃度的檢測(cè)，分析其和HBsAg高陽(yáng)性率的相關(guān)性是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并分析這種HBsAg高陽(yáng)性率是否和接種疫苗后產(chǎn)生的免疫效應(yīng)有直接關(guān)系，通過(guò)研究能夠?qū)εR床上出現(xiàn)的這種HBsAg高陽(yáng)性率給出科學(xué)的解釋。

1.2儀器與試劑:HBsAg檢測(cè)采用的儀器是雅培i2000SR，檢測(cè)方法為化學(xué)發(fā)光微粒子法，試劑是儀器配套進(jìn)口試劑。疫苗是重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)，北京天壇生物制品股份有限公司生產(chǎn)，相關(guān)試劑和疫苗均在有效期內(nèi)使用。

1.3方法:所有研究對(duì)象均是早晨空腹抽取靜脈血，離心分離血清進(jìn)行檢測(cè)的。選取本院2016年至2019年兒科病房及免疫門(mén)診0～1歲接種乙肝疫苗的嬰幼兒，接種后2周內(nèi)用化學(xué)發(fā)光微粒子法檢測(cè)HBsAg，檢出HBsAg低滴度陽(yáng)性的193例血清標(biāo)本進(jìn)行研究，并對(duì)這193例0～1歲嬰幼兒半年后同樣檢測(cè)方法再?gòu)?fù)檢HBsAg，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率，并對(duì)醫(yī)院常用的不同批次的3支疫苗進(jìn)行不同濃度稀釋后用同樣檢測(cè)方法檢測(cè)HBsAg，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性結(jié)果的稀釋倍數(shù)，再通過(guò)肌注疫苗后理論推算疫苗在不同階段的嬰幼兒體內(nèi)的濃度，對(duì)不同類(lèi)別檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中HBsAg的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為定量分析以>0.05IU/mL判定為陽(yáng)性。所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)SOP進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1193例接種乙肝疫苗的嬰幼兒半年以后復(fù)檢結(jié)果:0～1歲193例接種乙肝疫苗的嬰幼兒半年以后同樣方法復(fù)檢HBsAg結(jié)果189例轉(zhuǎn)陰，4例陽(yáng)性，陽(yáng)性率2.1%，其中有3例結(jié)果偏高，分別為11.30IU/mL、4.5IU/mL和9.20IU/mL，其中2例母親是HBsAg攜帶者，可能是新生兒分娩的過(guò)程中感染了母親的HBV，成為了HBsAg攜帶者，另一例可能為后天感染所致，還有一名復(fù)檢結(jié)果為弱陽(yáng)性，結(jié)果為0.80IU/mL，可能原因?yàn)閯偢腥净蚋腥净謴?fù)期。通過(guò)這些數(shù)據(jù)表明0～1歲嬰幼兒在接種了乙肝疫苗2周內(nèi)有一部分兒童會(huì)出現(xiàn)定量低滴度HBsAg陽(yáng)性的現(xiàn)象，隨著疫苗在體內(nèi)免疫過(guò)程的變化，只要不是真正的感染了HBV，HBsAg最終都會(huì)轉(zhuǎn)陰的。

2.2乙肝疫苗和注射后HBsAg出現(xiàn)陽(yáng)性的相關(guān)性分析：取三支不同批號(hào)的疫苗，其中2支是先稀釋5倍再進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?支是先稀釋2倍再進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)醚排鄆2000SR進(jìn)行化學(xué)發(fā)光微粒子法定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3通過(guò)表1分析疫苗稀釋到640倍后檢測(cè)到的結(jié)果為<0.05IU/mL，結(jié)果表現(xiàn)為陰性。根據(jù)嬰幼兒不同階段男女平均體重，理論上嬰幼兒的體液約占體重的60%～80%，其中細(xì)胞外液約占體重的20%左右，疫苗肌注到體內(nèi)按在細(xì)胞外液循環(huán)計(jì)算，一般新生兒都是注射劑量為0.5mL(10μg)的乙肝疫苗，按1克細(xì)胞外液約等于1mL計(jì)算，可以大致計(jì)算出0.5mL的疫苗注射到體內(nèi)在細(xì)胞外液中的稀釋倍數(shù)，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4根據(jù)表1可以看出即使是低體重的新生兒注射了疫苗后，疫苗在體內(nèi)細(xì)胞外液中的稀釋倍數(shù)也在1200倍以上，所以根據(jù)表1和表2推斷出嬰幼兒(無(wú)論男、女)接種了標(biāo)準(zhǔn)乙肝疫苗后，HBsAg在體內(nèi)的濃度應(yīng)該低于0.05IU/mL，檢測(cè)應(yīng)該表現(xiàn)為陰性，而實(shí)際出現(xiàn)HBsAg低滴度高陽(yáng)性率，可能原因?yàn)閶胗變鹤⑸淞瞬皇峭耆兓囊呙绾?，產(chǎn)生了免疫應(yīng)答效應(yīng)，導(dǎo)致HBsAg結(jié)果出現(xiàn)一過(guò)性低滴度陽(yáng)性反應(yīng)。

表1 三支乙肝疫苗倍比稀釋定量結(jié)果

表2 嬰兒不同年齡階段平均體重細(xì)胞外液及疫苗體內(nèi)稀釋倍數(shù)

3 討 論

通過(guò)對(duì)本院2016年至2019年兒科病房及免疫門(mén)診0～1歲接種乙肝疫苗的193例HBsAg低滴度陽(yáng)性的嬰幼兒的臨床研究，半年以后同樣方法復(fù)檢大部分轉(zhuǎn)陰，陽(yáng)性率只有2.1%，根據(jù)表1和表2的數(shù)據(jù)分析，0～1歲的嬰幼兒，接種了乙肝疫苗檢測(cè)HBsAg都應(yīng)該是陰性，而實(shí)際情況接種乙肝疫苗后2周內(nèi)檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性率很高，本院統(tǒng)計(jì)接近10%，國(guó)內(nèi)有些文章的研究得出HBsAg低滴度陽(yáng)性率可達(dá)15%[4]。國(guó)內(nèi)在近幾年就陸續(xù)發(fā)表文章報(bào)道新生兒接種了乙肝疫苗出現(xiàn)短暫HBsAg低滴度陽(yáng)性的情況[5～7]。由于過(guò)去化學(xué)發(fā)光技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有被普及應(yīng)用的時(shí)候，大部分實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HBsAg都是采用ELISA法，檢測(cè)結(jié)果為定性，檢測(cè)靈敏度不高，對(duì)一些臨界陽(yáng)性結(jié)果容易漏檢，一些研究表明化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)能提高HBsAg的陽(yáng)性率，能有效的減少HBsAg弱陽(yáng)性的假陰性率[8]，為了提高檢測(cè)的靈敏度，本課題采用化學(xué)發(fā)光微粒子法定量檢測(cè)HBsAg，因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光微粒子法使用的固相載體是直徑約2μm的順磁顆粒，具有表面積大、吸附效率高的特點(diǎn)，因此固相抗原或抗體的量增加，同時(shí)，增強(qiáng)的發(fā)光試劑可以使發(fā)光時(shí)間延長(zhǎng)、強(qiáng)度增加，使檢測(cè)靈敏度顯著提高。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，一支0.5mL的疫苗注射到剛出生的男嬰體內(nèi)平均稀釋倍數(shù)為1340倍，女?huà)塍w內(nèi)平均稀釋倍數(shù)為1260倍，隨著年齡增長(zhǎng)體重增加，稀釋倍數(shù)相應(yīng)加大，而實(shí)驗(yàn)分別對(duì)三支疫苗進(jìn)行倍比稀釋到640倍后化學(xué)發(fā)光微粒子法檢測(cè)結(jié)果為陰性，根據(jù)對(duì)疫苗稀釋實(shí)驗(yàn)得出嬰幼兒注射乙肝疫苗后幾乎不會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性，而實(shí)際檢測(cè)嬰幼兒注射乙肝疫苗2周內(nèi)的血清HBsAg陽(yáng)性率還很高，達(dá)到了10%左右，這應(yīng)該和一定的免疫機(jī)理有關(guān)?，F(xiàn)在市場(chǎng)上乙肝疫苗多是采用現(xiàn)代生物技術(shù)將乙肝病毒表達(dá)表面抗原的基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，克隆進(jìn)入釀酒酵母菌或CHO細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)中，通過(guò)培養(yǎng)這種重組酵母菌或CHO細(xì)胞來(lái)表達(dá)乙肝表面抗原亞單位，形成乙肝表面抗原蛋白，這種蛋白是一種乙肝病毒外衣殼蛋白，并非完整病毒[9]。原則上這種含有完全表面抗原蛋白的乙肝疫苗，是不含有病毒基因組的，被注射到人體，是不具有傳染性的，而新生兒實(shí)際注射了乙肝疫苗后2周內(nèi)仍有接近10%的HBsAg陽(yáng)性，可能原因?yàn)橐腋尾《颈砻婵乖|(zhì)粒構(gòu)建時(shí)未完全純化，可能存在極少量核心蛋白，因?yàn)榛蚪M是存在于核心蛋白中(HBcAg)，基因組在病毒的組裝和傳染過(guò)程中起著重要作用，核心抗原(HBcAg)同時(shí)也有很強(qiáng)的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生核心抗體(HBcAb)，有研究表明部分HBcAb陽(yáng)性者，體內(nèi)會(huì)存在低滴度HBsAg，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在部分人的血清中會(huì)檢測(cè)到一定量的乙肝病毒DNA[10]，和本課題研究的結(jié)果比較一致，所以注射了非純化的乙肝疫苗，即使疫苗是滅活的，但在短時(shí)間內(nèi)會(huì)存在低水平復(fù)制，導(dǎo)致新生兒注射了乙肝疫苗后2周內(nèi)會(huì)出現(xiàn)10%左右的低滴度陽(yáng)性，同時(shí)HBsAg的免疫原性和免疫反應(yīng)性，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)的保護(hù)性抗體，即HBsAb，中和掉了HBsAg，使陽(yáng)性者轉(zhuǎn)陰，同時(shí)HbcAg的免疫原性也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的HBcAb，產(chǎn)生的抗體會(huì)逐漸中和掉相應(yīng)的抗原，所以實(shí)際臨床中存在一部分打了疫苗幾個(gè)月以上出現(xiàn)HBsAb和HBcAb同時(shí)陽(yáng)性者，即所謂的乙肝五項(xiàng)中的二、五陽(yáng)性者，應(yīng)該就是這種情況引起的。

本課題193例研究對(duì)象中，半年后檢測(cè)HBsAg189例轉(zhuǎn)陰，有4例仍為陽(yáng)性，其中3例定量結(jié)果都比較高，2例是由母嬰傳播所致，另2例的HBsAg陽(yáng)性可能原因?yàn)楹筇旖佑|了乙肝病毒后感染所致，所以接種了乙肝疫苗的嬰幼兒HBsAg出現(xiàn)低滴度陽(yáng)性和疫苗接種直接相關(guān)，而且接種了乙肝疫苗的嬰幼兒，疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生了一定的免疫效應(yīng)，致使某些嬰幼兒體內(nèi)出現(xiàn)一過(guò)性HBsAg低滴度陽(yáng)性。

綜上所述，通過(guò)本次研究為臨床對(duì)鑒別新生兒是否感染了乙肝病毒提供了一定的理論依據(jù)，提高了大夫的臨床鑒別水平，0～1歲的嬰幼兒在接種了乙肝疫苗2周內(nèi)檢測(cè)HBsAg陽(yáng)性率比較高，陽(yáng)性標(biāo)本大部分表現(xiàn)為低滴度，所以建議接種了乙肝疫苗以后的新生兒，進(jìn)行HBsAg檢測(cè)時(shí)最好在2周以后，這樣HBsAg的陽(yáng)性率會(huì)大大降低。