郭 鑫， 諸葛姝芮， 齊旭升

(湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院兒科， 湖北 十堰 442000)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是一種以咳嗽為主要病癥的特殊支氣管哮喘，又稱之為咳嗽型哮喘。臨床主要癥狀為慢性持續(xù)性干咳，多以夜間咳嗽為主?？人宰儺愋韵愃朴诘湫偷南l(fā)病機(jī)制，主要與致敏、氣道炎癥和氣道重塑密切相關(guān)[1]。氣道重塑會造成氣道結(jié)構(gòu)的改變，氣道壁增厚，平滑肌增生以及炎性浸潤等；研究限制抑制炎癥反應(yīng)可以有效改善CVA癥狀[2]。目前NF-κB是一種與炎性反應(yīng)關(guān)系密切的信號通路分子，NF-κB信號通路廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，參與多種基因的調(diào)控，對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡、組織炎癥反應(yīng)等起著重要作用。目前臨床使用糖皮質(zhì)激素可以有效治療CVA，有學(xué)者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可以抑制炎癥反應(yīng)達(dá)到治療CAV的效果，有學(xué)者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素可以通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)特征實(shí)現(xiàn)治療CVA[3]。但目前關(guān)于糖皮質(zhì)激素治療CVA的機(jī)制尚不完全明確。本文通過構(gòu)建咳嗽變異性哮喘模型大鼠，用抗支糖漿與糖皮質(zhì)激素地塞米松聯(lián)合使用，研究抗支糖漿聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對咳嗽變異性哮喘模型大鼠的機(jī)制，為CVA患者的治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料：SD大鼠50只，購于由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022；抗支糖漿、地塞米松片分別購于重慶制藥廠有限公司和廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司。卵蛋白、氫氧化鋁干粉購于美國sigma公司；β-actin、NF-κB、MMP-9和VEGF、蛋白抑制劑等(Santa Cruz公司，美國)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG(Thermo公司，美國)；細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(Bio -Rad，美國)，霧化器(Boy 037G6000，德國Pari公司)DNM-9606酶標(biāo)分析儀(北京朗普新技術(shù)有限公司中國)；濕轉(zhuǎn)儀(AB公司，美國)；凝膠成像系統(tǒng)(DNR公司，以色列)，電泳儀(Bio-red，美國)，其他儀器購于德國eppendorf公司。

1.2方 法

1.2.1動物分組及模型構(gòu)建：將50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，10只每組分別為：對照組、模型組、抗支糖漿組、糖皮質(zhì)激素組和聯(lián)合用藥。對照組用生理鹽水致敏(1mL腹腔注射)和霧化激發(fā)。其余四組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)第1天、7d和14d腹腔注射1mL致敏溶液(10ug OVA和1mg氫氧化鋁)，第21天起作為激發(fā)時間起點(diǎn)，大鼠放在霧化吸入箱內(nèi)用霧化器霧化吸入30g/L OVA溶液5mL，3次/周，30min/次，連續(xù)激發(fā)三周；激發(fā)前30min；抗支糖漿組灌胃200uL/次；糖皮質(zhì)激素組灌胃等容積量的地塞米松片1.5mg/次；聯(lián)合用藥組灌胃200uL的抗支糖漿和1.5mg的地塞米松；對照組和模型組灌胃等體積量的生理鹽水。

1.2.2樣本采集：末次哮喘激發(fā)后24h，將大鼠處死，打開大鼠胸腔，完整取出大鼠的肺用于組織蛋白提取檢測或用4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，用于免疫組化分析。

1.2.3組織學(xué)檢測：大鼠的肺組織經(jīng)HE染色處理后，每個組織樣本選擇3張切片，采用美國圖像采集及圖像分析系統(tǒng)，用光筆描繪出氣道基底膜的周長及平滑肌的內(nèi)外分界線，測定基底膜周徑(Pbm)、內(nèi)管壁的面積(Wai)、支氣管平滑肌的面積(Wam)；用后兩個數(shù)值除以基底膜周徑，用于樣本組織的支氣管壁厚度、平滑肌厚度。

1.2.4組織樣本蛋白表達(dá)檢測：肺組織用剪刀剪取小塊，提取組織總蛋白，酶標(biāo)儀490nm波長條件下進(jìn)行蛋白定量。12% SDS-PAGE電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，4℃條件依次加入封閉液孵育2h，一抗孵育過夜(稀釋比例均為1∶1000)，二抗孵育2h(稀釋比例均為1∶5000)。以β-actin為內(nèi)參蛋白，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測分析蛋白條帶。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對于服從正態(tài)分布的連續(xù)型資料，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，當(dāng)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時，進(jìn)一步采用SNK方法進(jìn)行兩兩比較；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學(xué)改變：光鏡下分析HE的組織染色結(jié)果，如圖1所示：與對照組的氣道上皮完整，無明顯改變相比，模型組的肺組織及周邊組織結(jié)構(gòu)紊亂，氣道上皮組織壞死、脫落，存在大量炎性細(xì)胞浸潤，平滑肌面積增大，厚度增厚。其他治療三組的管腔規(guī)整，氣道壁及平滑肌無明顯增厚，氣道上皮存在少量炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色分析(×200)

2.2圖像分析檢測結(jié)果:通過圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分析各組大鼠肺組織樣本的平滑肌和支氣管壁厚度情況，結(jié)果如表1所示：與對照組組相比，其余4組的支氣管壁和平滑肌顯著增厚(P<0.05)；與模型組相比較，單獨(dú)用藥組和聯(lián)合用藥組的支氣管壁和平滑肌的增厚情況明顯改善，其組織厚度明顯降低(P<0.05)，且聯(lián)合用藥組的增厚情況明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥組(P<0.05)；而抗支糖漿和地塞米松之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析無意義(P>0.05)，表明抗支糖漿與糖皮質(zhì)激素地塞米松的聯(lián)合用藥能夠抑制哮喘大鼠模型的平滑肌和支氣管壁增厚。

圖2 westernblot蛋白分析

表1 各組大鼠支氣管壁和平滑肌增厚情況

2.3westernblot蛋白表達(dá)分析：Westernblot分析各組大鼠肺組織中IκB、NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示：與對照組相比，其余4組IκB表達(dá)量顯著降低，模型組基本不表達(dá)IκB蛋白，NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，單獨(dú)用藥組與聯(lián)合用藥組IκB蛋白表達(dá)增加，NF-κB、MMP-9和VEGF明顯降低(P<0.05)；單獨(dú)用藥組間蛋白表達(dá)量無顯著變化，聯(lián)合用藥組IκB表達(dá)增加量和NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)減少量明顯高于其他用藥組(P<0.05)。表明抗支糖漿與糖皮質(zhì)激素地塞米松的聯(lián)合用藥能夠抑制IκB蛋白的降解，下調(diào)NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)。

表2 westernblot蛋白分析

3 討 論

咳嗽變異性哮喘又稱咳嗽性哮喘，1972年Gluser首次報道了該病并命名為變異性哮喘，是指以慢性咳嗽為主要或唯一臨床表現(xiàn)的一種特殊類型哮喘[4]?？人宰儺愋韵R床主要癥狀為慢性持續(xù)性干咳，多以夜間咳嗽為主，患者在運(yùn)動后咳嗽的程度會有所加重，臨床無感染，長期的抗生素治療無效，表現(xiàn)出嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等增多，同時易出現(xiàn)氣道上皮組織化；基底膜、氣道平滑肌、氣道壁增厚[5]?？人宰儺愋韵愃朴诘湫偷南l(fā)病機(jī)制，主要與致敏、氣道炎癥和氣道重塑密切相關(guān)。

抗支糖漿聯(lián)合糖皮質(zhì)激素可以調(diào)控NF-κB(p65)蛋白的表達(dá)以及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平，實(shí)現(xiàn)調(diào)控炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)與CVA的關(guān)系密切[6]。NF-κB信號通路在機(jī)體中參與多種基因的調(diào)控，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[7]。當(dāng)患者的NF-κB信號傳遞途徑被激活以后，IκB蛋白會發(fā)生水解釋放出NF-κB蛋白進(jìn)入細(xì)胞核中參與對下游基因MMP9蛋白和VEGF蛋白的表達(dá)[8,9]。本文通過，研究抗支糖漿和糖皮質(zhì)激素地塞米松合用對咳嗽變異性哮喘模型大鼠的影響，通過組織染色發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥都能夠顯著降低模型大鼠，氣道壁及平滑肌無明顯增厚，氣道上皮存在少量炎性細(xì)胞浸潤；通過對組織的氣道壁和平滑肌厚度檢測發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合用藥能夠顯著與單獨(dú)用藥組和模型組相比，均能夠顯著抑制肺組織的氣道壁和平滑肌增厚；提取各組大鼠肺組織的總蛋白，通過westernblot分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比其余4組IκB表達(dá)量顯著降低，模型組基本不表達(dá)IκB蛋白，NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，單獨(dú)用藥組與聯(lián)合用藥組IκB蛋白表達(dá)增加，NF-κB、MMP-9和VEGF明顯降低(P<0.05)；單獨(dú)用藥組間蛋白表達(dá)量無顯著變化，聯(lián)合用藥組IκB表達(dá)增加量和NF-κB、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)減少量明顯高于其他用藥組(P<0.05)。

綜上所述：抗支糖漿和糖皮質(zhì)激素地塞米松合用，能夠通過NF-κB信號通路，抑制IκB蛋白水解，降低NF-κB的釋放，下調(diào)MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)，阻止肺部氣道壁和平滑肌的增厚，改善模型大鼠的哮喘癥狀。