趙 婷， 王彥梅， 王 樂

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院新生兒科， 新疆 烏魯木齊 830054)

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)在早產(chǎn)兒及存在呼吸系統(tǒng)問題的嬰兒出現(xiàn)的風險較高。妊娠26周之前出生的嬰兒中，超過70%會出現(xiàn)BPD[1]。組織學中BPD的特征是肺泡化不良、彈性蛋白沉積異常、纖維化、間充質(zhì)細胞增生和毛細血管生長異常，但BPD潛在的發(fā)病機制尚未完全清楚，且目前尚無預防或治療BPD的循證策略。維生素D(Vitamin D, VD)在體內(nèi)骨骼代謝和礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)中通過激活轉(zhuǎn)錄因子維生素D受體(Vitamin D receptor, VDR)發(fā)揮關(guān)鍵作用。除骨骼組織，VDR在人體的許多組織中表達，包括肺、胸腺、T淋巴細胞、嗜中性粒細胞、抗原呈遞細胞和樹突狀細胞等。而且VD通過影響細胞增殖和免疫功能在多種疾病(如癌癥，多發(fā)性硬化癥，糖尿病和心血管疾病)中發(fā)揮作用[2]。VD與先天免疫相關(guān)，而免疫相關(guān)組分同樣在BPD的發(fā)病機制中被涉及到。最近的研究表明，VD及VDR不僅參與調(diào)節(jié)炎癥和免疫力，還可能通過調(diào)節(jié)細胞增殖和分化相關(guān)基因，在慢性肺疾病的易感性中起重要作用[3]。VD可以作為胎兒肺發(fā)育的調(diào)節(jié)器，而且是Ⅱ型肺泡細胞和上皮細胞的生長和修復因子之一[4]?？紤]到其在調(diào)節(jié)先天免疫，炎癥，肺部發(fā)育和修復中的作用，因此VD和VDR可能與BPD的發(fā)病有關(guān)。發(fā)育過程中調(diào)節(jié)肺氣道和血管生長的關(guān)鍵信號尚不完全清楚，但已知的關(guān)鍵信號之一為血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。VEGF-A能夠刺激的內(nèi)皮細胞增殖，且認為其可驅(qū)動多種器官的血管生成，包括肺(發(fā)揮主要作用)。VEGF在中胚早期的血管發(fā)育中的關(guān)鍵作用已被證明，敲除VEGF基因甚至僅改變VEGF的單個等位基因即可破壞血管生長，甚至導致胚胎死亡。研究表明，VDR可以調(diào)節(jié)平滑肌細胞中VEGF相關(guān)信號通路，而且1,25(OH) 2 D3可通過VEGF啟動子中的VD反應(yīng)元件調(diào)節(jié)VEGF的生成[5]。然而VDR和VEGF在BPD中的作用仍不清楚。本研究建立BPD新生大鼠模型，研究VDR在BPD新生大鼠中的表達變化，并通過在體外改變VDR的水平討論VDR對肺上皮細胞的功能調(diào)控及對VEGF的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1試劑與耗材:SD大鼠購于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心(中國，新疆)。大鼠肺泡上皮Ⅱ型細胞(RLE-6TN)購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(中國，上海)。慢病毒包裝服務(wù)和小干擾RNA試劑盒購買于上海GenePharma公司(中國，上海)。LipofectamineTM 2000試劑盒購于美國英杰生命技術(shù)有限公司(美國，加利福尼亞州)。兔抗VEGF-A、VDR(或β-actin特異性的一抗與山羊抗兔二抗均購買于美國Abcam公司(美國，馬薩諸塞州)。ApopNexinTM異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡檢測試劑盒購上海碧云天生物技術(shù)公司(中國，上海)。MatrigelTM基質(zhì)購于美國BD生命科學公司(美國，新澤西州)。

1.2方 法

1.2.1新生大鼠模型:本研究所有涉及動物的實驗均通過我院倫理委員會的審查和批準。使用雌鼠孕21～23d自然分娩的新生大鼠。分組：新生大鼠分為BPD組(n=90)和對照組(n=10)，在12h內(nèi)使用吸氧體積分數(shù)為900mL/L誘導BPD模型，對照組則呼吸空氣。BPD模型制備：BPD組處理方法為：母鼠連同新生鼠置于氧箱內(nèi)，持續(xù)輸入O2，維持O2體積分數(shù)為900mL/L，CO2體積<5mL/L，氧箱內(nèi)溫度為25～28℃，濕度控制在65%。每隔24h開箱30min，添加水、糧、換墊料，并與對照組調(diào)換母鼠?？諝饨M母鼠同新生鼠均置于空氣中，具體方法和控制因素同BPD組。

1.2.2樣本收集:對照組和PBD組處理24h后計為1d，將2d、5d、7d的新生鼠，每組各選擇8只，用50g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，無菌取肺組織。用于VD的酶聯(lián)免疫吸附測定，VDR和VEGF-AmRNA的qRT-PCR及蛋白的Western blot檢測。

1.2.3細胞培養(yǎng):RLE-6TN使用1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10%胎牛血漿，細胞培養(yǎng)于5%CO2、濕度為37%的恒溫箱。隔2d換液一次。細胞生長至對數(shù)期，我們使用10moL/L維生素D(1,25(OH) 2 D3，VD)處理2h。

1.2.4VDR過表達和敲低慢病毒的細胞感染:RLE-6TN細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，細胞以胰酶消化計數(shù)后，用細胞計數(shù)板測出細胞密度，接種于6孔板中，每孔接種1.5×105。添加細胞培養(yǎng)液至2mL。16～20h后，計算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在-80℃的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；用移液槍小心吸去6孔板中的舊培養(yǎng)液，加入新的完全培養(yǎng)液；在細胞中分別加入計算好的慢病毒顆粒液，將培養(yǎng)板平置于工作臺上，以劃8字的方式輕柔混勻；混勻后，細胞培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞長滿后，傳代至6孔板中，加入嘌呤霉素(3μg/mL)，連續(xù)刷選1周，所得細胞即為穩(wěn)定表達細胞株。細胞慢病毒感染實驗分組為正常對照組、Le-VDR組、Le-Ctrl組、Sh-VDR組、Sh-Ctrl組。其中，實驗中RLE-6TN細胞感染VDR過表達慢病毒組命名為Le-VDR組，對應(yīng)的過表達對照組命名為Le-Ctrl；VDR敲低組命名為Sh-VDR組，對應(yīng)的敲低對照組命名為Sh-Ctrl。實驗中空白對照組為未進行處理的RLE-6TN細胞。

1.2.5VEGF-A小干擾RNA合成和細胞轉(zhuǎn)染:設(shè)計三個小的干擾RNA(siRNA，siVEGF-A-1，-2，-3)序列靶向VEGF-A區(qū)域，并由GenePharma公司合成。使用LipofectamineTM 2000試劑盒并根據(jù)制造商的說明進行轉(zhuǎn)染。用不同的siRNA序列(600 pmoL)轉(zhuǎn)染細胞，對照組為siRNA-NC，生長至融合度為50%至60%的細胞(每孔2×106個)，并在轉(zhuǎn)染后48 h收獲細胞。

1.2.6肺和細胞的總RNA的抽提和實時熒光定量PCR:根據(jù)制造商的說明使用TRIzol一步法從整個肺部組織(2d、5d、7d的新生大鼠)和細胞的Le-VDR、Le-Ctrl、Sh-VDR、Sh-Ctrl、siRNA-NC、siVEGF-A-1、-2、-3組中抽提總RNA。使用ND-1000紫外可見分光光度計檢測260nm和280nm的光密度(OD)。測定總RNA的質(zhì)量，并相調(diào)節(jié)RNA濃度。采用兩步法對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。使用以下反應(yīng)條件：70℃ 10min，冰浴2min，42℃ 60min和70℃10min。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA暫時置于-80℃。qRT-PCR使用TaqMan探針法進行。Taqman引物序列，VEGF-A正-5’-TAACGATGAAGCCCTGGAGTG-3’，反5’-AGGTTTGATCCGCATGATCTG-3’；探針：5’-6～FAM～TGCCCACGTCAGAGAGCAACATCAC～Black Hole Quencher1-3’；VDR正-5’-TGACCCCACCTACGCTGACT-3’，反-5’-CCTTGGAGAATAGCTCCCTGTACT-3’;探針：5’-FAM-ACTTCCGGCCTCCAGTTCGTATGGAC-TAMRA-3’。反應(yīng)條件如下：在95℃下預變性30s的一個循環(huán)，隨后在95℃下進行40個循環(huán)的10s變性，在60℃下退火10s。并在70℃下延伸10s。β-actin用于內(nèi)參基因。用2-ΔΔCt方法計算VDR和VEGF-A的mRNA相對表達。每個實驗重復3次。

1.2.7Western blot分析:從組織或細胞樣品中提取的總可溶性蛋白質(zhì)(100 μg)在12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶封閉，隨后用對兔抗VEGF-A(1：600)、VDR(1：500)或β-actin(1：5000)特異性的抗體進行孵育。隨后將膜與山羊抗兔二抗(1：5000)進行孵育，并使用增強的化學發(fā)光法進行觀察。

1.2.8免疫熒光:準備RLE-6TN細胞爬片，使用血清封閉切片后，用VEGF-A(1：600)一抗孵育(稀釋比例為1:50)，與FITC偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗以1：200的稀釋度進行孵育。最后使用Hoechst 33258復染并用共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.9CCK-8檢測細胞增殖:將細胞的Le-VDR、Le-Ctrl、Sh-VDR、Sh-Ctrl、siRNA-NC、siVEGF-A-1、-2、-3組細胞(每孔1×104)鋪在96孔板中，并用增殖試劑盒(CCK-8)檢測細胞增殖。用美國BIO-RAD酶標儀讀取光密度。

1.2.10流式細胞儀檢測細胞凋亡:將各處理組的細胞(每孔1×105)鋪在六孔板中，孵育24h后，通過ApopNexinTM異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡。在流式細胞儀(CytomicsTM FC 500)檢測并分析凋亡率變化。

1.2.11傷口愈合實驗分析:將各處理組的細胞(106個細胞/mL)接種到24孔塑料細胞培養(yǎng)板中，當細胞長成單層時，用200μL移液管吸頭直線劃刻該單層細胞以形成人為的劃痕區(qū)域。用光學顯微鏡(Nikon，TE2000-S)隨時間記錄劃痕區(qū)的表面積。拍照評估每組轉(zhuǎn)染細胞中的遷移水平。

1.2.12附著力檢測:在接種轉(zhuǎn)染的細胞之前，于96孔板上涂5μg MatrigelTM基質(zhì)(BD Biosciences，MA，美國)。溫育1h后，將孔用PBS洗滌兩次以除去未粘附的細胞，將其固定在低聚甲醛中，并用Giemsa染色劑染色。隨后在顯微鏡下觀察貼壁細胞，并在八個隨機視野中計算每個視野的貼壁細胞數(shù)量。

1.3統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。t檢驗用于比較符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)差異，若不符合或分布形態(tài)未知則采用U檢驗。差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1BPD肺組織中VD和VDR明顯下調(diào):評估VD和VDR在對照組和BPD組2d、5d、7d的新生大鼠肺中的表達水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，BPD新生大鼠5d和7d的肺組織中VD(P<0.05，P<0.05)、VDR mRNA(P<0.05，P<0.05)和VDR蛋白(P<0.01，P<0.01)表達水平都降低，差異均有統(tǒng)計學意義(圖1A-C)。

圖1 Reduced levels of VD and VDR in lung tissue of BPD neonatal rats. (A) Changes in lung VD levels measured by enzyme-linked immunosorbent assay; (B) Changes in mRNA levels of VDR in lung tissues of newborn BPD rats detected by RT-qPCR; * P<0.05, compared with control group; (C) Western blot was used to detect changes in VDR protein levels in lung tissues of newborn BPD rats.

2.2體外實驗觀察VDR對細胞功能的影響：確定VDR失調(diào)對細胞功能的影響。RLE-6TN細胞分別感染Le-VDR、Le-Ctrl、Sh-VDR、Sh-Ctrl。Western blot結(jié)果，與Le-Ctrl組相比，Le-VDR組的VDR表達增加；與Sh-Ctrl組相比，Sh-VDR組的VDR表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(圖2A,P<0.01)。CCK-8檢測結(jié)果，與Sh-Ctrl組相比，Sh-VDR降低了培養(yǎng)細胞的增殖活力，差異有統(tǒng)計學意義(圖2B，P<0.05)；而Le-VDR提高了培養(yǎng)細胞的增殖活力，差異有統(tǒng)計學意義(圖2B，P<0.05)。此外，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果，與Sh-Ctrl組相比，Sh-VDR誘導細胞凋亡，而Le-VDR則具有相反的作用，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2C)。評估VDR是否有助于細胞遷移和粘附。圖2D中，與Sh-Ctrl相比，Sh-VDR組遷移降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而感染Le-VDR的細胞中細胞遷移增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。圖2E中，粘附試驗結(jié)果顯示，與Sh-Ctrl相比，Sh-VDR組粘附能力降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而感染Le-VDR的細胞中細胞粘附增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 VDR affects the biological function of cells. (A) Cells were infected by Le-Ctrl, Le-VDR, Sh-Ctrl, Sh-VDR, VDR protein expression in cells were tested by Western blot; (B) Cell proliferation was detected by CCK-8 method; (C) Apoptosis was measured by flow cytometry; (D) Wound healing experiments to measure cell migration levels; (E) Cell adhesion experiment was used to detect the changes of adhesion levels.

2.3VD和VDR促進VEGF-A表達:與對照組和Le-Ctrl組比較，VD處理和Le-VDR感染的RLE-6TN細胞中VEGF-A的mRNA水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05，圖3A)；VD處理和Le-VDR感染的細胞中VEGF-A的蛋白水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05，圖3B)。另外，與Sh-Ctrl組比較，Sh-VDR感染的細胞中VEGF-A的mRNA和蛋白水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05，圖3A和3B)。

圖3 VD and VDR regulated VEGF-A expression. (A) The mRNA level of VEGF-A was detected by RT-qPCR; (B) The protein level of VEGF-A was detected by Western blot. * P<0.05, compared with the control group; # P<0.05, compared with Le-Ctrl; & P<0.0.5 compared with Sh-Ctrl.

2.4沉默VEGF-A抑制體外細胞的遷移和粘附能力：siRNA-NC、siVEGF-A-1、-2、-3分別轉(zhuǎn)染RLE-6TN細胞，siVEGF-A-3抑制了VEGF-A的表達,差異有統(tǒng)計學意義(圖4A，P<0.01)。免疫熒光染色法進一步證實了siVEGF-A-3抑制VEGF-A的表達(圖4B)。與siRNA-NC相比，沉默VEGF-A抑制細胞的遷移能力(圖4C，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；與siRNA-NC相比，抑制VEGF-A還能降低細胞的粘附能力(圖4D，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖4 Effect of silencing VEGF-A on cell migration and adhesion. (A) Cells were transfected by si-VEGF-A-1, -2, -3, VEGF-A protein levels were detected by Western blot; ** P<0.01 compared with si-NC;(B) Cell immunofluorescence was used to detect the expression of VEGF-A in cells; (C) Cell migration level was measured in wound healing experiments; (D) Adhesion level changes were detected by cell adhesion experiments.

2.5VDR過表達恢復沉默VEGF-A對細胞遷移和粘附的影響：Le-VDR與siVEGF-A-3共同處理RLE-6TN細胞，與Le-Ctrl+siVEGF-A-3相比，Le-VDR+siVEGF-A-3組的VEGF-A蛋白表達部分上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(圖5A，P<0.01)；與Le-Ctrl+siVEGF-A-3相比，Le-VDR+siVEGF-A-3上調(diào)細胞的遷移能力(圖5B，P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義；與Le-Ctrl+siVEGF-A-3相比，Le-VDR+siVEGF-A-3上調(diào)細胞的粘附能力(圖5C，P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖5 VDR overexpression restored the effects of silencing VEGF-A on cell migration and adhesion. (A) si-VEGF-A-3 combined with Le-VDR or Le-Ctrl were co-transfected cells, VEGF-A protein expression was detected by Western blot; (B) cell migration level was measured by wound healing experiment; (C) Cell adhesion levels were measured by adhesion experiments. ** P<0.01, compared with si-NC; ## P<0.01, compared with Le-Ctrl + siVEGF-A-3.

3 討 論

本研究表明，BPD新生大鼠的VD、VDR、VEGF-A的水平表達均降低，而研究通過敲低VDR和沉默VEGF在體外復現(xiàn)了BPD模型肺泡上皮細胞的特性，這些數(shù)據(jù)暗示，改變VDR表達和VEGF可能有助于BPD的發(fā)展。

最近證據(jù)表明，VD和VDR通過調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移從而與腫瘤發(fā)展相關(guān)[6]。與該研究類似，本研究觀察到當VDR在RLE-6TN細胞中過度表達時，細胞增殖、粘附、傷口愈合能力明顯增強，且細胞凋亡被抑制，然而下調(diào)VDR則有相反的作用，這表明VDR可影響肺泡上皮細胞的生物學功能。已證明VDR在細胞分化中起著至關(guān)重要的作用，尤其是對于肌細胞和成肌細胞分化的影響。此外，VDR與慢性阻塞性肺病具有相關(guān)性[7]。VDR可協(xié)調(diào)神經(jīng)和氣道平滑肌發(fā)育[8]。我們同樣發(fā)現(xiàn)異常表達的VD和VDR與BPD相關(guān)，表明VD可能通過活化/誘導VDR的表達從而調(diào)節(jié)肺上皮細胞的功能。

細胞遷移和粘附作用和細胞外基質(zhì)(ECM)的異常重塑均與BPD的發(fā)病機制有關(guān)[9]。隨著BPD的發(fā)展，與遷移、粘附、ECM重塑、纖維化相關(guān)的基因功能失調(diào)，這些基因包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、膠原蛋白-1α、金屬蛋白酶1(TIMP-1)。VEGF對血管生成具有關(guān)鍵作用，是調(diào)節(jié)腫瘤細胞粘附和轉(zhuǎn)移關(guān)鍵分子。本研究發(fā)現(xiàn)敲低VEGF-A抑制肺上皮細胞的傷口愈合及粘附作用，這與以往研究一致，而且VEGF-A的表達在BPD新生大鼠的肺組織中均下調(diào)。說明VEGF-A是潛在的BPD調(diào)節(jié)基因之一。

另外，研究表明VD通過VDR介導VEGF生成，VEGF和血小板源性生長因子受體信號轉(zhuǎn)導共同調(diào)控血管生成活性，表明VEGF信號可能是VD發(fā)揮一系列功能的下游靶點[8]。VEGF是早期血管發(fā)育的關(guān)鍵因子，VEGF基因缺失可抑制內(nèi)皮細胞增殖破壞血管生長，甚至導致胚胎死亡。可見，VEGF在組織發(fā)育過程中扮演關(guān)鍵角色。重要的是，已證實VD能通過促進VEGF啟動子中的VD反應(yīng)元件從而調(diào)節(jié)VEGF生成[5]。本研究同樣證明BPD肺組織中VD及VDR的表達降低，而且體外證實VD和VDR均可以促進肺上皮細胞中VEGF-A的表達。說明VD和VDR可能通過上調(diào)VEGF-A從而調(diào)節(jié)肺上皮細胞的粘附和遷移能力。我們進一步的驗證實驗發(fā)現(xiàn)VDR過表達可改善因敲低VEGF-A對肺上皮細胞的粘附和遷移的抑制作用。而且敲低VEGF-A表達還可以被VDR過表達部分恢復。因此，VD和VDR可能通過調(diào)節(jié)VEGF-A可能參與BPD的發(fā)展。

綜上所述，本研究表明，由于VD和VDR下調(diào)導致的VEGF-A水平降低在BPD新生大鼠肺上皮細胞功能和ECM重塑中起著至關(guān)重要的作用。本研究的結(jié)果初步建立一種VD和VDR介導VEGF-A功能調(diào)節(jié)BPD發(fā)病的機制，有助于拓展BPD疾病的潛在基因治療方法。本研究成果仍需在體內(nèi)實驗中進一步深入探究。