吳 瑤 許碧磊 ,2 郭 方 董 寧 于 燕 祝筱梅 姚詠明

(1.解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新研究部創(chuàng)傷修復(fù)與組織再生研究中心，北京 100048；2.武漢市普仁醫(yī)院體檢中心，湖北 武漢 430081)

膿毒癥和多器官功能障礙綜合征（MODS）是現(xiàn)代重癥醫(yī)學的難題，其確切發(fā)病機制尚未充分理解，尤其是對機體免疫功能紊亂的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)以及可調(diào)控的作用靶點認識不足，尚沒有可應(yīng)用于臨床的行之有效的防治措施[1-3]。樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是體內(nèi)功能最強的專職抗原呈遞細胞，其大量凋亡以及抗原呈遞能力的降低是機體免疫功能抑制、抗感染能力下降、并發(fā)膿毒癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。我們團隊的前期研究表明，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)誘導DC大量凋亡在嚴重燙(燒)傷小鼠免疫功能紊亂發(fā)生的信號機制中具有重要意義[5-6]。但是目前對于過度ERS反應(yīng)的關(guān)鍵誘發(fā)因素尚不明確。高遷移率族蛋白B1 (high mobility group box-1 protein, HMGB1) 作為一種重要的晚期炎癥因子，參與了膿毒癥病理過程。本研究探討HMGB1是否通過誘導ERS反應(yīng)導致燒傷小鼠脾臟DC過度凋亡，以及拮抗HMGB1對燒傷小鼠的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康 Balb/C小鼠（SPF清潔級），雄性，6～8周，體重（20±2）g，購自北京華阜康科技股份有限公司。CD11c+免疫磁珠、MS柱、LS柱購自德國Miltenyi Biotec公司；藻紅蛋白標記抗CD11c+抗體(PE-CD11c)、細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；HMGB1購自美國R&D公司；HMGB1兔多克隆中和抗體委托北京康為世紀生物科技有限公司定制；Salubrinal（Sal）購自美國Selleck公司；抗GRP78(Bip)抗體、CHOP抗體購自美國Cell Signaling Test公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔二抗、HRP標記羊抗小鼠二抗購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；小鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、RPMI-1640、胎牛血清購自依科賽生物科技有限公司。MiniMACS磁性分選儀為德國Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品；流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-7)為北京六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)Image Quant LAS 4000 為美國GE公司產(chǎn)品。

1.2 小鼠嚴重燒傷模型復(fù)制 小鼠禁食12 h，經(jīng)5%水合氯醛0.2 ml腹腔注射進行麻醉，刮剃背部和側(cè)腹部毛后，浸于(99.0±0.5)℃水浴中7 s，形成12% TBSA的Ⅲ度燒傷區(qū)，燒傷部位涂20 g/L碘伏進行抗感染處理(每日2次)，傷后1 h耳后皮下注射1 ml/kg林格液抗休克。假傷組小鼠除所浸水浴為37 ℃外，其余處理同燒傷組。

1.3 動物分組與處理 ①燒傷模型小鼠和假傷組小鼠于燒傷后1、2、3、5、7 d處死小鼠，留取血清和脾臟，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清HMGB1水平，Western Blot檢測脾臟HMGB1蛋白水平。②將燒傷模型小鼠和假傷組小鼠均隨機分為3組：HMGB1抗體干預(yù)組于燒傷（或假傷）后6 h、18 h經(jīng)尾靜脈注射定制的抗HMGB1中和抗體(兔免疫血清純化產(chǎn)物，抗體效價1:27 000，每只200 μl)；未免疫血清干預(yù)組同樣方法給予等量的未經(jīng)免疫的兔血清IgG；生理鹽水對照組同樣方法注射等量生理鹽水。部分批次小鼠用于7 d生存率觀察，各實驗組樣本數(shù)為：燒傷組44只，燒傷后HMGB1抗體干預(yù)組45只，燒傷后未免疫血清干預(yù)組44只，假傷組（生理鹽水對照）16只。另有部分小鼠于48 h后處死，留取脾臟，Western Blot方法檢測脾臟DC中ERS相關(guān)分子蛋白的表達（n=3）。③ 正常小鼠給予亞致死量HMGB1(每只10 μg或20 μg)經(jīng)尾靜脈進行體內(nèi)注射，48 h后處死小鼠，留取脾臟，分離提純CD11c+DC后用于ERS相關(guān)分子蛋白水平的檢測。

1.4 小鼠脾臟DC分離與鑒定 無菌留取小鼠脾臟，嚴格按照試劑盒操作說明，應(yīng)用鼠淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque)分離出單個核細胞懸液，與CD11c+免疫磁珠共孵育，用MiniMACS磁化細胞分選儀分離純化，所獲得的DC細胞進行細胞活性鑒定和純度檢測，確定適合用于后繼實驗。

1.5 HMGB1誘導DC凋亡及ERS反應(yīng)的體外實驗正常小鼠脾臟DC 用細胞培養(yǎng)液(RPMI-1640，含10%胎牛血清)重懸，調(diào)整為2×106/ml，接種到細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)箱中進行適應(yīng)性培養(yǎng)（37oC，5%CO2)，24 h后隨機分為以下5組：正常對照組，1 ng/ml HMGB1低劑量刺激組，10 ng/ml HMGB1中劑量刺激組，100 ng/ml HMGB1高劑量刺激組，以及salubrinal (Sal)干預(yù)組（20 μmol/L Sal預(yù)處理1 h后加入HMGB1刺激），培養(yǎng)24 h后收集各組細胞，檢測DC凋亡及DC中ERS相關(guān)分子蛋白水平。

1.6 DC凋亡率測定 收集細胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，用 100 μl結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸，按照試劑盒說明進行PE-Annexin Ⅴ和7-AAD染色，避光孵育(室溫，15 min)后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 Western blot檢測小鼠脾臟HMGB1及ESR相關(guān)分子GRP78、XBP-1、sXBP-1、CHOP蛋白表達 收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次后離心棄上清，細胞團加入200 μl細胞裂解液 (含混合蛋白酶抑制劑)充分混勻，放置冰上30 min，然后浸入液氮反復(fù)凍融3次，低溫高速離心機12 000 r/min離心15 min，留取上清，利用BCA法進行蛋白濃度測定，調(diào)整蛋白濃度一致后按比例與上樣緩沖液混勻，98 ℃煮沸5 min，冷卻，4 ℃冰箱保存。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）進行蛋白電泳后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫下應(yīng)用10%脫脂奶粉溶液孵育2 h，按順序進行相應(yīng)的一抗、二抗孵育后，凝膠成像系統(tǒng)進行顯影，Quantity One軟件分析，結(jié)果以灰度值表示。

1.8 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，q檢驗進行組間兩兩比較；χ2檢驗比較各組存活率差異。雙側(cè)P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 嚴重燒傷致HMGB1水平升高及抗HMGB1中和抗體的保護作用 與假傷組相比，小鼠脾臟及血清HMGB1蛋白水平在燒傷后1 d即有明顯升高，于燒傷后2～3 d達到峰值，并持續(xù)保持較高水平至5～7 d（見圖1）。于傷后6、18 h給于抗HMGB1中和抗體干預(yù)，以未免疫兔血清IgG為對照，觀察小鼠7 d生存率，結(jié)果顯示，嚴重燒傷小鼠7 d存活率為38.64%（17/44只），抗HMGB1中和抗體可有效提高燒傷小鼠7 d存活率至71.11%（32/45只），且明顯較未免疫血清干預(yù)組存活率52.27%（23/44只）為高（P＜0.05，見圖2）。

圖1 小鼠脾臟及血清中HMGB1蛋白檢測（A：Western blot技術(shù)分析小鼠脾臟組織HMGB1含量；B：ELISA方法檢測小鼠血清HMGB1水平）

圖2 抗HMGB1中和抗體干預(yù)對嚴重燒傷小鼠生存率的影響

2.2 HMGB1誘導燒傷小鼠脾臟DC的過度ERS反應(yīng) 小鼠給予抗HMGB1中和抗體或未免疫血清干預(yù)，48 h后處死，檢測脾臟DC中ERS相關(guān)分子蛋白的表達，結(jié)果顯示，拮抗HMGB1可顯著抑制燒傷應(yīng)激引起的小鼠脾臟DC中的ERS反應(yīng)，與未免疫血清干預(yù)組相比，DC中的ERS標志分子GRP78表達水平以及XBP-1的表達和活化水平（sXBP-1）均明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 HMGB1中和抗體減輕燒傷小鼠脾臟DC中ERS反應(yīng)

應(yīng)用重組HMGB1攻擊正常小鼠，可誘導脾臟DC發(fā)生明顯的ERS。不同劑量HMGB1體內(nèi)注射均可誘導GRP78表達升高及XBP-1表達/活化水平的上調(diào)，且呈一定的劑量依賴性。見圖4。

2.3 HMGB1對DC凋亡的直接誘導效應(yīng)及其與ERS的相關(guān)性 HMGB1體外刺激可誘導小鼠脾臟DC發(fā)生凋亡，與正常對照組相比，DC經(jīng)HMGB1刺激24 h，凋亡率明顯增加(P＜0.05)，以10 ng/ml組升高最為顯著(P＜0.01)，見圖5。同時檢測DC中ERS相關(guān)分子蛋白水平， 結(jié)果顯示，HMGB1刺激可直接誘導DC中ERS相關(guān)蛋白表達增加(P＜0.05)，其中GRP78表達隨HMGB1刺激濃度的增加而增加，ERS相關(guān)性細胞凋亡途徑中的關(guān)鍵分子CHOP在10 ng/ml劑量組表達最強(P＜0.01)，與HMGB1誘導DC凋亡效果一致，見圖6。

圖4 HMGB1攻擊誘導正常小鼠脾臟DC中ERS反應(yīng)的發(fā)生

圖5 不同濃度HMGB1刺激對DC凋亡的影響(n=3)

為探討ERS在HMGB1誘導DC凋亡中的作用，我們進一步應(yīng)用Salubrinal (可緩解ERS反應(yīng)，減輕ERS所致細胞凋亡)進行干預(yù)。DC給予Sal預(yù)處理(20 μmol/L，1 h)可明顯減輕不同劑量HMGB1刺激誘導的DC凋亡(P＜0.01)，見圖7。與單獨應(yīng)用HMGB1刺激DC相比，給予Sal預(yù)處理的DC 其ERS相關(guān)細胞凋亡的關(guān)鍵分子CHOP蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，見圖8。

3 討 論

嚴重創(chuàng)（燒）傷后機體很早期即出現(xiàn)細胞免疫功能障礙的現(xiàn)象，機體免疫功能紊亂是創(chuàng)傷并發(fā)膿毒癥的重要病生理基礎(chǔ)[3]。目前已知DC是體內(nèi)功能最強的專職抗原呈遞細胞，被認為是免疫系統(tǒng)的啟動者，處于免疫調(diào)控中心位置[7-8]。研究表明，燒（創(chuàng)）傷感染并發(fā)膿毒癥過程中，DC的凋亡以及免疫功能異常是導致機體免疫功能障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是，對于膿毒癥狀態(tài)下DC凋亡的具體分子機制及可能的調(diào)控環(huán)節(jié)目前尚未闡明。進一步明確燒（創(chuàng)）傷后影響DC功能狀態(tài)的主要因素及探索可能的調(diào)控靶點具有重要病理生理意義及臨床實用價值。

圖6 不同濃度HMGB1刺激對DC ERS相關(guān)蛋白表達的影響(n=3)

圖7 Sal干預(yù)對HMGB1誘導DC凋亡率的影響(n=3)

圖8 Sal干預(yù)對HMGB1誘導DC中ERS相關(guān)蛋白表達的影響(n=3)

HMGB1是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，進化上高度保守，能夠參與基因轉(zhuǎn)錄、DNA重組、修復(fù)等多種生物學過程。存在于真核細胞的細胞核中的HMGB1可分泌至細胞外，參與機體免疫反應(yīng)的調(diào)控，在膿毒癥發(fā)病及進展中起著重要作用。近年來研究證實，嚴重燒（創(chuàng)）傷時血清及組織中HMGB1水平升高與嚴重感染和休克患者的不良預(yù)后及膿毒癥模型動物的高死亡率密切相關(guān)[9-10]。多項研究證實，拮抗HMGB1的生物學作用可有效保護損傷的組織細胞[11-12]。本研究中，嚴重燒傷小鼠血清及脾臟組織內(nèi)HMGB1蛋白水平明顯升高，抗HMGB1中和抗體干預(yù)可提高燒傷小鼠生存率，具有明確保護作用，與前期報道結(jié)果一致。HMGB1除作為晚期促炎因子在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮潛在的中心作用外，還作為免疫刺激因子調(diào)控免疫細胞的功能狀態(tài)及凋亡，介導機體免疫功能紊亂，對感染、休克、燒（創(chuàng)）傷、膿毒癥等急危重癥的病程進展發(fā)揮重要作用[13]。本室前期研究表明，HMGB1作為一種潛在免疫調(diào)節(jié)因子，對DC以及T淋巴細胞的功能狀態(tài)具有重要調(diào)節(jié)作用，特別是對DC的成熟分化可發(fā)揮雙向調(diào)控作用[14]。本研究中細胞實驗結(jié)果證實，HMGB1對體外培養(yǎng)的正常小鼠脾臟DC的凋亡具有直接誘導效應(yīng)，提示嚴重燒（創(chuàng)）傷后體內(nèi)高水平HMGB1誘導DC大量凋亡可能是導致機體免疫功能發(fā)生紊亂的重要機制所在。

ERS是近年來廣受關(guān)注的一種真核細胞內(nèi)重要的內(nèi)源性保護機制，對提高應(yīng)激狀態(tài)下細胞適應(yīng)力和耐受力至關(guān)重要。但ERS持續(xù)存在或者反應(yīng)過強時則激活ERS相關(guān)性細胞凋亡通路(ERassociated death，ERAD)[15]，引發(fā)細胞大量死亡。本室前期研究結(jié)果顯示，ERS在介導HMGB1對DC免疫功能調(diào)節(jié)中具有重要意義[5]；而且，過度ERS誘導細胞凋亡通路活化是嚴重燒傷小鼠脾臟DC大量凋亡以及機體免疫功能障礙發(fā)生的重要機制[6,16]。本研究在前期工作成果的基礎(chǔ)上，進一步探討在燒（創(chuàng)）傷后體內(nèi)高水平HMGB1刺激誘導DC凋亡的信號機制中ERS的地位及意義，以深入探索DC凋亡機制中的可干預(yù)環(huán)節(jié)。研究結(jié)果顯示，正常小鼠進行重組HMGB1體內(nèi)注射可誘導脾臟DC中ERS反應(yīng)的重要生物學標志分子GRP78及ERS介導細胞凋亡的關(guān)鍵分子CHOP的表達水平明顯上調(diào)。而且，本實驗中還發(fā)現(xiàn)，嚴重燒傷小鼠給予抗HMGB1中和抗體干預(yù)可緩解脾臟DC中的ERS反應(yīng)水平。上述實驗結(jié)果提示，嚴重燒傷后體內(nèi)高水平HMGB1是誘導DC內(nèi)發(fā)生明顯ERS反應(yīng)以及ERS相關(guān)性細胞凋亡的重要因素，緩解過激的ERS反應(yīng)水平可能是抗HMGB1中和抗體保護效應(yīng)的重要機制所在。

進一步的體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，HMGB1誘導DC凋亡過程中伴有明顯的ERS反應(yīng)，HMGB1刺激誘導DC中GRP78蛋白表達上調(diào)，并隨刺激濃度增加而增加；CHOP蛋白表達水平明顯上調(diào)，與DC凋亡趨勢一致。而且，我們應(yīng)用一種明確可減輕ERS相關(guān)性細胞凋亡的選擇性eIF2α脫磷酸作用抑制劑Sal[17]對DC進行預(yù)處理，可明顯減輕HMGB1誘導的DC凋亡的發(fā)生。這些數(shù)據(jù)提示ERS相關(guān)性細胞凋亡通路的活化在HMGB1誘導DC凋亡機制中發(fā)揮重要作用。

本研究中初步探討了HMGB1刺激誘導DC發(fā)生ERS相關(guān)性細胞凋亡及其與嚴重燒傷小鼠脾臟DC功能障礙間的內(nèi)在聯(lián)系。拮抗嚴重燒傷小鼠體內(nèi)高水平HMGB1作用可有效緩解脾臟DC中過激ERS反應(yīng)；而且，緩解ERS反應(yīng)水平的干預(yù)措施可降低HGMB1誘導的ERS相關(guān)性細胞凋亡。明確調(diào)控ERS的確切分子信號機制及可能的干預(yù)靶點，尋找控制ERS反應(yīng)“適度” 的有效調(diào)控措施，將為改善膿毒癥患者免疫細胞功能狀態(tài)、尋找膿毒癥治療靶標、尋求膿毒癥新的干預(yù)方法提供新思路。