劉廣建 鄭惠華 蔣 益 張 辰 薛 璟 季宏更 張 蕾

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）最早源于中國，俗稱北蟲草，其藥用價值與冬蟲夏草相似，為國內(nèi)外公認的食藥用真菌。

優(yōu)良的菌株是提高食用菌液體發(fā)酵水平的關(guān)鍵。目前，針對蛹蟲草等食藥用菌育種方法主要有自然選擇、誘變育種和雜交育種。除利用紫外線、激光和化學(xué)誘變劑等物理化學(xué)誘變因素來篩選出優(yōu)良食用菌菌株外，目前研究人員越來越重視利用原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因重組技術(shù)等來構(gòu)建新型食用菌發(fā)酵菌株。近幾年ARTP（常壓室溫等離子體誘變）技術(shù)在微生物育種中受到了重視。與傳統(tǒng)誘變方法相比，采用ARTP 能夠有效造成DNA 多樣性的損傷，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變菌株；與分子育種相比，ARTP 誘變育種具有操作簡便、成本低、無有毒有害物質(zhì)參與誘變過程等優(yōu)點。因此，ARTP 在對代謝復(fù)雜的微生物進行誘變育種時，顯示出獨特的優(yōu)勢；ARTP 對環(huán)境無污染，操作安全。近年來，ARTP 誘變技術(shù)被廣泛運用于細菌、酵母、霉菌、放線菌等誘變育種，而在食用真菌菌種（蛹蟲草）誘變選育方面很少有報道。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）出發(fā)菌株：SWCor-01，來自江蘇省蘇微微生物研究有限公司。

（2）培養(yǎng)基：固態(tài)培養(yǎng)基為PDA；原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基為麥芽糖5 g，葡萄糖10 g，酵母粉4 g，瓊脂5.5 g，0.6 mol/L 甘露醇溶液 1 000 mL，pH 自然；液體發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母膏0.8%，蛋白胨0.6%，葡萄糖3%，MgSO40.05%，KH2PO40.1%，維生素B110 mg/L。

（3）主要儀器和試劑：常壓室溫等離子體育種機器（ARTP）（無錫源清天木生物科技有限公司），DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠），溶壁酶（廣東微生物研究所）。三種滲透壓穩(wěn)定劑分別為0.6 mol/L蔗糖，0.6 mol/L甘露醇，0.6 mol/LNaCl。

1.2 試驗方法

1.2.1 出發(fā)菌株準(zhǔn)備

取PDA 斜面上生長旺盛的菌絲，接種于液體培養(yǎng)基中，26 ℃靜置培養(yǎng)，每天早晚各搖動一次。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備

用鎳絲網(wǎng)過濾收集上述培養(yǎng)2～5 d 的菌絲體，用無菌水和滲透壓穩(wěn)定劑，分別洗滌一次，再懸浮于含滲透壓穩(wěn)定劑的2%的溶壁酶酶液中（酶液用0.25 μm 微孔濾膜過濾除菌），間歇搖動，32 ℃酶解2～5 h 后，用8 層擦鏡紙過濾去除殘留的菌絲，離心收集原生質(zhì)體，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2次后，再加入滲透壓穩(wěn)定劑制成懸浮液，然后用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整到原生質(zhì)體為106/mL。試驗選用三種滲透壓穩(wěn)定劑（0.6 mol/L 蔗糖，0.6 mol/L 甘露醇，0.6 mol/L NaCl），制備三種原生質(zhì)體懸浮液。

1.2.3 ARTP誘變處理

原生質(zhì)體懸浮液上樣量10 μL，處理功率120 W，處理距離2 mm，氣流量10 SLM，處理時間（s）為0、20、40、60、80、100、120、150、180、240，每個梯度做3個平行。將誘變后的菌液用0.6 mol/L 的滲透壓穩(wěn)定劑稀釋涂布平板，計算致死率，繪制致死率曲線，選擇致死率為90%時的處理時間為最佳處理時間，對原生質(zhì)體進行誘變處理。誘變處理三種原生質(zhì)體懸浮液，計算致死率，確定最佳參數(shù)。

1.2.4 誘變菌株的篩選及同工酶電泳試驗驗證

采取拮抗反應(yīng)，聚丙烯酰銨電泳技術(shù)結(jié)合酯酶同工酶和過氧化物同工酶酶譜分析初篩、鑒定誘變菌株。將初篩后得到的誘變菌株，以出發(fā)菌株為對照，進行液體搖瓶發(fā)酵試驗，對比菌絲體產(chǎn)量和菌絲體蛋白含量。

1.2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗

將獲到的較理想的目標(biāo)菌株，通過6 次傳代培養(yǎng)，液體發(fā)酵試驗，觀察新菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變蛹蟲草原生質(zhì)體最佳條件的確定

ARTP 對蛹蟲草原生質(zhì)體誘變后的致死率因滲透壓穩(wěn)定劑而異。由圖1 可以看出，以0.6 mol/L 蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑，ARTP 處理120 s 時致死率才67%，在 120～240 s 致死率無明顯變化，300 s 時才76.6%；以0.6 mol/L 甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑，ARTP處理240 s 致死率才63%；0.6 mol/L NaCl 為滲透壓穩(wěn)定劑，ARTP 處理40 s 致死率發(fā)生明顯變化，為61%，240 s 為93%，達最佳致死率指標(biāo)。因此將誘變最佳條件設(shè)定為：以0.6 mol/L NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑，處理功率120 W，處理距離2 mm，氣流量10SLM，處理時間為240 s。

圖1 ARTP處理后SW Cor01原生質(zhì)體致死率

2.2 誘變菌株的篩選及同工酶電泳試驗分析

2.2.1 誘變菌株的初篩

將ARTP 誘變處理后的菌懸液涂布于再生培養(yǎng)基平板（在最佳誘變條件的確定過程中一共做了4次試驗），一共涂布了800 多塊平板，觀察有無拮抗反應(yīng)、菌落長勢形態(tài)，初篩誘變菌株，篩選出300 多株誘變菌株；將篩選出的300 多株菌株轉(zhuǎn)接平板再篩選：平板（PDA）中心為對照菌株，四周接8 株誘變菌株。觀察有無拮抗反應(yīng)、菌落形態(tài)等，結(jié)果共篩選出82 株菌株；將82 株菌株分別再與對照菌株進行兩兩拮抗試驗，一共挑選出33 株具有明顯拮抗、菌絲生長速度快的菌株。并對33 株菌株進行液體發(fā)酵試驗、同工酶電泳試驗的復(fù)篩。

圖2 部分誘變菌株拮抗試驗照片

2.2.2 誘變菌株的復(fù)篩

2.2.2.1 同工酶電泳分析

凝膠電泳顯示酯酶同工酶酶譜從陰極向陽極有14 條不同酯酶同工酶條帶，這14 條譜帶的Rf值在0.1～0.9，誘變菌株酶帶數(shù)量有一定的差異，其中出發(fā)菌株有 9 條酶帶，Cor15003 有 11 條，Cor16011有 7 條，Cor20004 有 8 條，Cor22021 有 8 條 Cor27012有11 條，共有譜帶為3、8、9、11、12、13，部分菌株同工酶酶譜分析結(jié)果見圖3。將同工酶電泳分析篩選獲得13株變異菌株進行液體發(fā)酵試驗。

圖3 部分誘變菌株同工酶電泳分析圖譜

2.2.2.2 液體發(fā)酵試驗

液體發(fā)酵試驗方法參照文獻[9]。26 ℃恒溫搖床140 r/min 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5 d 后，測定菌絲生物量、菌絲體蛋白含量、菌絲體蛋白得率（表1）。

表1 13株誘變菌株與對照菌株液體發(fā)酵結(jié)果

由表1 可見，菌絲體蛋白含量高于對照有4 株，其中菌絲體蛋白含量最高的菌株為Cor15003，高于對照10.18%；液體發(fā)酵生物量高于對照菌株的有5株，其中Cor27012、Cor15003 分別較對照提高了76.4%、27.35%；菌絲體蛋白得率高于對照的有4株，其中Cor27012、Cor15003 分別較對照提高了76.62%、40.30%。

2.2.2.3 液體發(fā)酵罐工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)驗證試驗

發(fā)酵罐（通氣加攪拌）容積200 L，裝液量120 L，攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，通氣量1∶0.5～1，壓差法接種，接種量為8%，25～26 ℃培養(yǎng)。添加0.1%豆油作為消泡劑，發(fā)酵72 h，結(jié)果見表2。

表2 200 L罐液體發(fā)酵結(jié)果

從表2可以看出，Cor15003、Cor27012比對照液體發(fā)酵菌絲生物量分別提高13.66%、20.67%，蛋白得率分別提高25.48%、20.85%。

2.3 遺傳穩(wěn)定性試驗

為了分析誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，對兩株優(yōu)勢菌株進行遺傳穩(wěn)定性試驗。兩株菌株在固體培養(yǎng)基上進行了6代傳代培養(yǎng)后，進行液體發(fā)酵試驗，結(jié)果見表3。由表3 可知，傳代后菌株的菌絲體生物量、蛋白含量、蛋白得率與傳代前幾乎一致，Cor15003號菌株表現(xiàn)最優(yōu)。

表3 傳代菌株發(fā)酵試驗結(jié)果

3 小結(jié)與討論

食藥用菌突變菌株的篩選是一個很繁雜的工程，目前尚未找到一些簡便的方法，比如營養(yǎng)缺陷型的篩選，主要通過菌株之間的拮抗，菌落形態(tài)及生長勢進行初篩，感官意識比較強。因此試驗設(shè)計時就要求較高致死率（90%），這樣平板菌落數(shù)就比較少，便于初篩。試驗獲得了一組最佳誘變參數(shù)：以0.6 mol/LNaCl 為滲透壓穩(wěn)定劑，處理功率120 W，處理距離2 mm，氣流量10SLM，處理時間為240 s，致死率93%。成功篩選到兩株高蛋白突變菌株：Cor27012、Cor15003。試驗結(jié)果說明最佳致死率，提高了菌株的誘變率、降低了篩選的難度，但由于對特定菌株的篩選有很大的隨機性，所以最佳致死率不一定能篩選到理想菌株。

三種穩(wěn)滲劑中，0.6 mol/L 的甘露醇、0.6 mol/L 的蔗糖致死率較低，0.6 mol/L NaCl 為滲透壓穩(wěn)定劑，進行ARTP 誘變，高能He 離子的穿透力比較強，致死率比較高。

目前，常壓室溫等離子體作為一種新的誘變源，因其獨特的誘變機理和生物效應(yīng)在微生物育種中得到迅速推廣。ARTP 對生物的遺傳物質(zhì)損傷效果明顯、損傷機制豐富，尤其是對于染色體等真核生物的遺傳物質(zhì)均有很強的損傷效果；因而ARTP較其他誘變方法顯示出更高效的突變性能、更廣譜的適用范圍。試驗對應(yīng)用ARTP 技術(shù)選育食用菌新菌株具有指導(dǎo)作用。