江芝瑤

【摘 要】CRISPR Cas9基因切割技術(shù)是近幾年人們在基因水平研究上的新突破，它能夠通過Cas9核酸酶實現(xiàn)對多個基因的切割，人們利用這個技術(shù)，能系統(tǒng)的了解各基因的功能和作用，并為許多遺傳性疾病提供全新的治療方式。該項技術(shù)主要通過干涉可分化干細(xì)胞、基因編輯重編程和修飾基因這三種途徑來預(yù)防和治療疾病，目前科學(xué)家們在這方面已經(jīng)展開了許多研究，并取得了一定進(jìn)展，實現(xiàn)臨床治療是CRISPR Cas9基因切割技術(shù)下一步最大的發(fā)展目標(biāo)，未來該項研究也必定會獲得更為突破性的進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】CRISPR Cas9技術(shù);疾病;治療

【中圖分類號】R596.2【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B ? ?【文章編號】1002-8714（2020）07-0123-02

CRISPR Cas9基因切割技術(shù)作為在基因水平上的一項新研究，為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的許多疾病治療提供了一種全新的途徑。它通過系統(tǒng)內(nèi)的Cas9核酸酶對目標(biāo)DNA進(jìn)行切割，從而實現(xiàn)對患病基因的修復(fù)。由于CRISPR Cas9技術(shù)允許人們對基因進(jìn)行高精度修復(fù)，因此對該技術(shù)展開深入研究和廣泛應(yīng)用對醫(yī)學(xué)界有著重大的影響。

1 CRISPR Cas9基因切割技術(shù)介紹

CRISPR Cas9系統(tǒng)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）序列系統(tǒng)線性排列在DNA鏈上，該系統(tǒng)對于原核生物來說，可以使自身體內(nèi)的細(xì)菌在經(jīng)歷數(shù)次病毒攻擊后自行形成免疫防御系統(tǒng)。

這三個功能區(qū)對于整個系統(tǒng)來說都有不同的作用，CRISPR序列相當(dāng)于一個基因收集庫，用來編碼用來切割DNA的crRNA，它由多組重復(fù)序列組成，其中也包含小部分間區(qū)序列。Cas基因序列種類很多，有1-10等多種不同類型，它用來編碼引導(dǎo)crRNA切割指定DNA鏈的Cas9核酸酶，而tracrRNA就是由CRISPR序列根據(jù)其收集到的細(xì)菌信息轉(zhuǎn)錄而來。

CRISPR Cas9技術(shù)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1977年，當(dāng)時桑格發(fā)明了基因測序方法，而CRISPR Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)就開始于細(xì)菌測序中。1987年，日本大阪大學(xué)的實驗工作者在對一種大腸桿菌的堿性磷酸酶同工酶進(jìn)行測序的過程中，發(fā)現(xiàn)在某段基因編碼序列的終止密碼子后存在一段由簡單重復(fù)序列組成的DNA片段，同時在片段兩端還存在一段不太長的特有序列，但由于當(dāng)時關(guān)于生物的研究發(fā)展仍存在很多不足，學(xué)界并未對該現(xiàn)象展開更深入的研究。到了21世紀(jì)初，有研究者發(fā)現(xiàn)這種“簡單重復(fù)序列”的系統(tǒng)在>40%的細(xì)菌中和>90%的古生菌中都有廣泛存在，這種普遍性引起了一些科學(xué)家的重視，兩年之后，這套“簡單重復(fù)序列”被首次命名為CRISPR。經(jīng)過科學(xué)家的不斷深入研究，在2005年發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)序列來自于噬菌體，并且有人推測這套系統(tǒng)與細(xì)菌和古生菌的獲得性免疫有關(guān)，并在2007年第一次證實CRISPR的作用是獲得性免疫。之后，對于CRISPR的研究更加注重各部分的功能和整個過程的形成。比如在2008年，人們發(fā)現(xiàn)Spacers可以轉(zhuǎn)錄形成crRNA起到指導(dǎo)Cas靶向性的作用，并且證實CRISPR的靶點(diǎn)是DNA。一年后，科學(xué)家們又發(fā)現(xiàn)了TypeIII-B結(jié)構(gòu)，同時進(jìn)一步得出CRISPR也能夠?qū)NA進(jìn)行切割的結(jié)論。在2011年，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄形成的tracrRNA和crRNA可以形成二聚體，并與Cas9組成復(fù)合體。更為重要的是人們在同一年還證實了CRISPR系統(tǒng)可以用在細(xì)菌和古生菌以外的其他物種，這為CRISPR Cas9技術(shù)在人類疾病中的應(yīng)用做了鋪墊。緊接著，科學(xué)家們又在體外證實了Cas能夠?qū)NA進(jìn)行切割，而2013年第一次證實CRISPR可以用于哺乳動物的編輯讓該技術(shù)成功吸引了無數(shù)生物學(xué)研究者，同時，研究人員已成功在人類、小鼠、斑馬魚及擬南芥、水稻等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。

通過科學(xué)家們不斷地深入研究，目前已知的CRISPR Cas系統(tǒng)主要有3種，分別是Type I、Type II和Type III。進(jìn)一步根據(jù)cas基因種類分，還可以將Type II類型細(xì)分為Type IIA、Type IIB和Type IIC[1]。

2 CRISPR Cas9技術(shù)在疾病治療方面的應(yīng)用以糖尿病治療為例

2.1糖尿病介紹

人體內(nèi)胰島素分泌相對或絕對不足均會導(dǎo)致糖尿病的產(chǎn)生。I型糖尿病為自身免疫性疾病，其從起病之初就伴隨胰島β細(xì)胞的凋亡。II型糖尿病最初的表現(xiàn)為胰島素抵抗，其疾病末期也伴隨胰島β細(xì)胞的丟失。因此，治療糖尿病最重要的工作就是尋找新胰島β細(xì)胞。目前，應(yīng)用CRISPR Cas9技術(shù)，可以實現(xiàn)從干細(xì)胞中分化、基因編輯和修飾基因三種途徑來獲取胰島β細(xì)胞。

2.2 CRISPR Cas9技術(shù)在糖尿病治療方面的應(yīng)用

① 從干細(xì)胞中分化

人胚胎干細(xì)胞（hESCs）可以分化成胰島細(xì)胞。前兩種細(xì)胞也被稱為人多能干細(xì)胞，它們在表達(dá)特定轉(zhuǎn)錄因子并激活或抑制特定信號通路后，可以定向分化為胰島譜系細(xì)胞。在CRISPR Cas9技術(shù)出現(xiàn)以前，人們只能明確少數(shù)幾種轉(zhuǎn)錄因子的功能，而仍有很多重要信息未被發(fā)現(xiàn)，CRISPR Cas9技術(shù)出現(xiàn)之后，人們能夠利用該技術(shù)篩選胰腺發(fā)育時需要的關(guān)鍵因子，并確定其功能，從而推動人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成胰島譜系細(xì)胞。不僅如此，CRISPR Cas9技術(shù)還能夠?qū)崿F(xiàn)將單個基因位點(diǎn)與患病癥狀相聯(lián)系，方便醫(yī)生針對癥狀尋找問題。隨著人們對每個物質(zhì)系統(tǒng)的研究，有科研小組通過CRISPR Cas9技術(shù)發(fā)現(xiàn)NEUROG3在人胚胎干細(xì)胞分化的過程中起到非常重要的作用;而另一組研究團(tuán)隊則對8個胰腺轉(zhuǎn)錄因子的作用進(jìn)行了對照分析，發(fā)現(xiàn)PDX1不足也會影響胰腺內(nèi)分泌發(fā)育;而一些中美科學(xué)家們結(jié)合CRISPR Cas9與其他一系列技術(shù)，發(fā)現(xiàn)胰島素不足可來源于CDKAL1、KCNJ11、KCNQ1中的基因突變，同時他們還發(fā)現(xiàn)，T5224這種物質(zhì)可以減少由于CDKAL突變而導(dǎo)致的胰腺β細(xì)胞缺失，進(jìn)而將T5224這種化合物研發(fā)成T5224（AP-1抑制劑）這種化學(xué)藥品，從而修復(fù)CDKAL1突變引起的胰島β細(xì)胞缺失;人們還發(fā)現(xiàn)STAT3 K392R突變也會導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能缺失，運(yùn)用CRISPR Cas9技術(shù)可使突變恢復(fù)原來狀態(tài)，防止誘導(dǎo)多能干細(xì)胞不正確的分化。在相關(guān)領(lǐng)域，人們已經(jīng)利用小鼠開展了許多嘗試，比如，有研究人員發(fā)現(xiàn)，插入Pax4基因可以使小鼠干細(xì)胞產(chǎn)生胰島素;在鼠胰腺被膜下多注射間充斥干細(xì)胞也可促進(jìn)胰島素產(chǎn)生;把基因編輯后的胰高血糖素樣肽1基因在小鼠皮膚細(xì)胞中培養(yǎng)，小鼠的體重和血糖水平在4個月的時間里得到了調(diào)節(jié)和控制[1]。

② 基因編輯

在胰腺外分泌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、肝胰膽管細(xì)胞和胃竇細(xì)胞可通過基因編輯變?yōu)橐葝u素分泌細(xì)胞這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，科學(xué)家們可運(yùn)用CRISPR Cas9技術(shù)在胰島β細(xì)胞缺失后人工進(jìn)行基因編輯，從而防止疾病發(fā)生。目前，人們已經(jīng)篩選出進(jìn)行基因編輯的轉(zhuǎn)錄因子最佳組合PNM，它包括了Pdx1、Ngn3和MafA三種因子，但將PNM注射入小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，基因編輯效率只有20%。

③ 修飾基因

運(yùn)用CRISPR Cas9技術(shù)可以修飾與引發(fā)糖尿病有關(guān)的22種相關(guān)基因，編輯單個基因是該項技術(shù)成功率相對較高的應(yīng)用，但糖尿病屬于多基因遺傳病，因此難度也會相應(yīng)提高。目前，修飾基因仍停留在導(dǎo)入正?；騺韽浹a(bǔ)缺陷基因的水平上。

2.3 展望

雖然CRISPR Cas9技術(shù)的運(yùn)用為糖尿病治療提供了三種新途徑，但每種方法仍存在一定的問題。利用人體干細(xì)胞分化成胰島譜系細(xì)胞，很有可能會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng);而基因編輯的效率與成熟度較低，同時不同的成熟體細(xì)胞間表觀遺傳學(xué)存在不同，基因編輯無法進(jìn)入調(diào)控胰島細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)，編輯后的細(xì)胞仍無臨床治療功能;修飾基因則無法很好保證其安全性，效率也有待提高。針對以上這些問題，研究人員開發(fā)出了一套精確度更高的脫靶效應(yīng)檢測方法——“體內(nèi)非靶點(diǎn)驗證”，或也可嘗試通過對Cas蛋白和sgRNA的改進(jìn)來降低脫靶發(fā)生;為應(yīng)對PAM序列的限制，人們同樣也對Cas蛋白進(jìn)行了改造，獲得spCas9-NG這一變體，消除了PAM序列的限制，或也可使用Cas9直系同源酶;為應(yīng)對效率低的問題，可以發(fā)明新的轉(zhuǎn)染方式或是建立更加穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系。

3 結(jié)語

CRISPR Cas9基因切割技術(shù)讓人們能夠在基因的水平上對其進(jìn)行高精度的修改與編輯，這在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)上都是巨大的突破。雖然CRISPR Cas9技術(shù)尚未成熟，仍存在如脫靶現(xiàn)象等一系列問題，但研究人員一直致力于解決目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR Cas9技術(shù)有可能引發(fā)的問題，并不斷探索該技術(shù)未被發(fā)現(xiàn)的隱患，倘若CRISPR Cas9技術(shù)能進(jìn)一步發(fā)展，那么它在研究各物質(zhì)作用與功能、治療疾病等方面都將大放異彩，成為人類強(qiáng)有力的研究工具。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊佳儒， 郭美華， 柳愛華， et al. CRISPR-Cas9的原理及其應(yīng)用進(jìn)展[J]. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2016， 37（5）：118-122.