徐 穎 賀 黎 呂嘉櫪 余海霞 王雪瑩

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 西安710021）

有機(jī)硒較無機(jī)硒吸收利用率高且毒副作用小，然而，人工合成有機(jī)硒技術(shù)難度大，成本高。以乳酸菌為載體，將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒是一個有效的微生物轉(zhuǎn)化途徑。富硒乳酸菌具有抗菌[1-2]，抗氧化[3]，抗癌[4]等生物活性，近年來引起廣泛關(guān)注[5-9]。然而，微生物在多次連續(xù)傳代中容易發(fā)生退化，遺傳穩(wěn)定性可能發(fā)生改變，導(dǎo)致其生理、生化特征變化，從而使菌株質(zhì)量下降。富硒乳酸菌如果作為長期連續(xù)使用的產(chǎn)業(yè)化菌種，不僅應(yīng)具備優(yōu)異的益生特性，還應(yīng)具備較好的穩(wěn)定性。近年來，乳酸菌富硒菌種的篩選及發(fā)酵工藝研究取得顯著成果[10-14]，而對富硒乳酸菌傳代穩(wěn)定性的研究較少。本試驗著重研究富硒能力較強(qiáng)的鼠李糖乳桿菌的傳代穩(wěn)定性，優(yōu)化富硒鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑的配比。這對于開發(fā)富硒產(chǎn)品和為食品提供硒源，具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌Lr-1 和Lr-2 均由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實驗室提供；亞硒酸鈉，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；MRS 培養(yǎng)基，北京奧博星生物有限責(zé)任公司；海藻糖、脫脂乳粉、谷氨酸鈉，上海源葉生物科技有限公司；木糖醇，西安皓源生物技術(shù)有限公司；麥芽糊精，山東西王糖業(yè)有限公司，其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

722E 型分光光度計，上海光譜儀器有限公司；IRIS Intreid II 電感耦合等離子發(fā)射光譜，美國Thermofisher 公司；VEGA-3-SBH 掃描電鏡-能譜儀，捷克TESCAN 公司；FD5-series 真空冷凍干燥機(jī)，美國FREEZE DRYER 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鼠李糖乳桿菌富硒穩(wěn)定性研究

1.3.1．1 菌種活化 為提高菌種的活力，將菌株接種到液體MRS 培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，連續(xù)活化3 代。

1.3.1．2 生長曲線的繪制 將活化好的第3 代菌按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔3 h 在波長600 nm 處測定吸光值。

1.3.1．3 菌株傳代培養(yǎng) 將活化至第3 代的菌液，以1%的接種量接種于液體MRS 培養(yǎng)基中。為了確保菌種在傳代過程中的穩(wěn)定性，每次將菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期時再進(jìn)行轉(zhuǎn)接。

乳酸菌以二分裂的方式增殖，即經(jīng)過n 次分裂增殖后細(xì)菌數(shù)為2n個。在每個培養(yǎng)周期內(nèi)，菌體以100 倍增殖，即每個培養(yǎng)周期內(nèi)的生長代數(shù)為log2100 ≈6.64 代（24 h 即為6.64 代，1 個月可以傳到200 代）[15]。

1.3.1.4 掃描電鏡觀察生長周期末活菌數(shù)變化取20 mL 菌懸液于3 500 r/min 條件下離心10 min 得菌體，置于1.5 mL 離心管中，加入2.5%的戊二醛，在37 ℃下固定4 h，磷酸緩沖溶液（pH 7.2）清洗3 次后，梯度乙醇脫水，并加入等體積的乙酸異戊酯置換乙醇，每次持續(xù)20 min。棄去乙酸異戊酯，將樣品于-20 ℃條件下預(yù)凍12 h 后凍干。對樣品噴金后，于掃描電鏡-能量色散X 射線光譜儀下觀察菌體表面狀態(tài)。

在菌株傳代過程中，每培養(yǎng)50 代測定各個菌株在培養(yǎng)周期末（24 h）的活菌數(shù)。樣品經(jīng)生理鹽水倍比稀釋到合適梯度后，采用MRS 固體培養(yǎng)基平皿傾注法，于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h 后計菌落總數(shù)，選取菌落數(shù)在30～300 之間的平板作為活菌總數(shù)測定的指標(biāo)。

1.3.2 富硒培養(yǎng) 按體積比為1%的接種量將菌液接種于MRS 肉湯液體培養(yǎng)基，于第6 h 加入亞硒酸鈉母液1 mL，使亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10 μg/mL，于37 ℃培養(yǎng)24 h。3 500 r/min 條件下離心10 min 得菌體，用生理鹽水洗滌菌體2 次，50 ℃烘干至恒重。用電感耦合等離子發(fā)射光譜（ICP-OES）法[13]測定菌株富硒量和硒轉(zhuǎn)化率。富硒量和硒轉(zhuǎn)化率分別按式（1）和（2）計算：

1.3.3 富硒乳酸菌凍干保護(hù)劑配比優(yōu)化

1.3.3.1 富硒乳酸菌凍干工藝流程 菌種活化→菌種富硒培養(yǎng)→離心收集菌體→生理鹽水清洗菌體→按料液比1∶5 添加保護(hù)劑溶液→預(yù)凍→真空冷凍干燥（24 h）→原體積復(fù)水→活菌計數(shù)→計算活菌率。

1.3.3.2 富硒乳酸菌凍干保護(hù)劑配比單因素試驗如表1所示，本試驗共選取5種常用乳酸菌凍干保護(hù)劑，查閱相關(guān)文獻(xiàn)給出的保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍，設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度進(jìn)行單因素試驗，測定c1、c2，凍干存活率R 按式（3）計算[16]：

表1 富硒鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑單因素試驗Table 1 Single factor experiments of lyophilized protectant of selenium-enriched Lactobacillus rhamnosus

1.3.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化富硒乳酸菌凍干保護(hù)劑配比 綜合單因素試驗的結(jié)果，選取其中3種對凍干存活率影響顯著的保護(hù)劑，設(shè)計三因素三水平試驗，采用Design-Expert 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，優(yōu)化富硒鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑配比。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌生長曲線的繪制

由圖1可知，鼠李糖乳桿菌Lr-1 和Lr-2 生長情況良好，延滯期很短，很快進(jìn)入對數(shù)期，在12 h 進(jìn)入對數(shù)末期，21 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，為方便試驗，確定傳代培養(yǎng)周期為24 h。由圖2可知，2 株鼠李糖乳桿菌生長過程中不斷產(chǎn)生乳酸，pH 逐漸降低，培養(yǎng)18 h 后pH 基本穩(wěn)定在4.1～4.2 范圍內(nèi)。

2.2 鼠李糖乳桿菌傳代過程中生長狀況

由圖3可知，鼠李糖乳桿菌在連續(xù)傳代第7，14，21，28，35 天時，活菌數(shù)出現(xiàn)先增多后減少的現(xiàn)象，但不同代數(shù)間差距較小，由于菌株傳代過程中難免會有部分菌株死亡，導(dǎo)致活菌數(shù)出現(xiàn)波動?？傮w來看，鼠李糖乳桿菌Lr-1 和Lr-2 在0～250代期間，活菌數(shù)變化處于動態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)。

2.3 掃描電鏡結(jié)果分析

由圖4可知，2 株鼠李糖乳桿菌均呈短桿狀，排列緊密，傳代過程中菌株形態(tài)未發(fā)生明顯變化，說明鼠李糖乳桿菌具有傳代穩(wěn)定性。

圖1 2 株鼠李糖乳桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of two strains of Lactobacillus rhamnosus

圖2 2 株鼠李糖乳桿菌生長過程中pH 的變化Fig.2 Changes on pH of two strains of Lactobacillus rhamnosus during growth

2.4 鼠李糖乳桿菌傳代過程中富硒情況

由表2可知，2 株鼠李糖乳桿菌在0～250 代期間，富硒量和硒轉(zhuǎn)化率有所波動，但不顯著（P＞0.05），Lr-1 平均富硒量為429.99 μg/g，平均硒轉(zhuǎn)化率為28.32%；Lr-2 平均富硒量為398.14 μg/g，平均硒轉(zhuǎn)化率為25.57%。表明鼠李糖乳桿菌富硒能力在傳代過程中并未發(fā)生退化，并且菌株Lr-1的富硒能力略優(yōu)于Lr-2（故凍干保護(hù)劑研究中以菌株Lr-1 為主）。本研究由于受時間等因素限制，未能考察傳250 代以上的情況，這需要后續(xù)試驗進(jìn)一步研究。

2.5 富硒鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑單因素試驗結(jié)果

由圖5可知，添加海藻糖、脫脂乳粉、谷氨酸鈉3種凍干保護(hù)劑時，富硒鼠李糖乳桿菌凍干存活率較高，海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時凍干存活率最高為67%、谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時凍干存活率最高為53%、脫脂乳粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時凍干存活率最高為45%；麥芽糊精和木糖醇凍干保護(hù)效果弱些，麥芽糊精質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時凍干存活率最高為32%、木糖醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%時凍干存活率最高為26%。

表2 2 株鼠李糖乳桿菌富硒能力變化Table 2 Changes on selenium-enriched capacity of two strains of Lactobacillus rhamnosus

海藻糖、麥芽糊精、木糖醇等可代替水分子與細(xì)胞膜磷脂雙分子層產(chǎn)生氫鍵而起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用[17]。此外，還可以維持相變溫度的穩(wěn)定，保持磷脂雙分子層的通透性，防止細(xì)胞在脫水干燥、貯存期間發(fā)生內(nèi)溶物泄漏[18-19]。脫脂乳粉屬于蛋白質(zhì)類保護(hù)劑，通過在細(xì)胞外形成蛋白膜，降低相變溫度，增加細(xì)胞膜剛性和流動性，減少在凍干期間細(xì)胞的損傷和死亡[20]。Corveleyn等[21]研究了谷氨酸鈉在鼠李糖乳桿菌、糞腸球菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和腸球菌冷凍干燥過程中的作用，發(fā)現(xiàn)谷氨酸鈉明顯提高了菌株凍干存活率。張國強(qiáng)[22]用2種單糖（葡萄糖、果糖）、4種雙糖（麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖）、1種多糖（葡聚糖）、2種醇類（山梨醇、甘露醇）和谷氨酸鈉作酒酒球菌SD-2a 的凍干保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn)2.5%谷氨酸鈉效果最好，凍干存活率達(dá)（69.5±2.7）%。

圖5 富硒鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑單因素試驗Fig.5 Single factor experiments of lyophilized protectant of selenium-enriched Lactobacillus rhamnosus

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌凍干保護(hù)劑配比結(jié)果

綜合單因素試驗的結(jié)果，采用響應(yīng)面法，依據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，對乳酸菌凍干保護(hù)劑配比進(jìn)行優(yōu)化，選擇添加保護(hù)劑為海藻酸鈉、脫脂乳粉、谷氨酸鈉3 個因素進(jìn)行考察。響應(yīng)面試驗各因素水平表如表3所示，試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表4所示。

表3 試驗各因素水平表Table 3 Test factors and levels

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 4 Response surface test design plan and results

2.6.1 回歸模型的建立及顯著性分析 運用Design-Expert 8.0.6 軟件，對多項式回歸分析，得到的二次回歸方程為：凍干存活率=90.08-0.14A-1.75B+0.31C+1.10AB-2.73AC+1.40BC-1.10A2-3.83B2-4.05C2

由上式可以看出，在各因素對凍干存活率的影響中，一次項的偏回歸方程系數(shù)的絕對值從大到小依次為B＞C＞A，說明加脫脂乳粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對凍干存活率的影響最大，其次是谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響最小?；貧w模型的方差分析如表5所示。

由表5可知，在用回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2＝0.993），Prob＞F 值（0.0006）小于0.01，方程極其顯著，由此證明該試驗方法是可靠的，可用于富硒乳酸菌凍干保護(hù)劑配比優(yōu)化試驗設(shè)計模型。失擬項表示試驗預(yù)測值與實測值不擬合的概率，也就反映了擬合出來的模型與試驗數(shù)據(jù)的接近程度，其Prob＞F（0.7675）大于0.05，不顯著，表示回歸模型適合，試驗數(shù)據(jù)可靠，分析的結(jié)果可靠。

2.6.2 富硒鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑配比優(yōu)化結(jié)果 通過Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析，得到的富硒鼠李糖乳桿菌最佳凍干保護(hù)劑配比為：海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%、脫脂乳粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。為了驗證試驗結(jié)果與實際情況是否一致，根據(jù)上述試驗結(jié)果添加凍干保護(hù)劑，所得到的凍干存活率，重復(fù)3 次計算平均值，得到凍干存活率為89.85%，與預(yù)期的結(jié)果90.08%相近，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。添加凍干保護(hù)劑的凍干存活率比不加凍干保護(hù)劑時提高81.85%。

表5 回歸模型的方差分析表Table 5 Analysis of variance for regression model

3 結(jié)論

鼠李糖乳桿菌Lr-1 和Lr-2 在傳代250 代以內(nèi)，菌株形態(tài)未發(fā)生明顯變化，富硒能力較穩(wěn)定未發(fā)生退化，從5種凍干保護(hù)劑中優(yōu)化出富硒鼠李糖乳桿菌Lr-1 最佳凍干保護(hù)劑配比為海藻糖7%、脫脂乳粉10%、谷氨酸鈉5%，富硒鼠李糖乳桿菌凍干存活率可達(dá)89.86%。本文對于開發(fā)富硒產(chǎn)品，為食品提供硒源，具有十分重要的意義。后續(xù)試驗還可以進(jìn)一步考察傳代250 代以上的富硒鼠李糖乳桿菌穩(wěn)定性及其富硒能力，使本研究更加完善。